劉立新，張羽男，張強(qiáng)，張楠楠

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯154007）

紫花苜蓿多糖的體外抗腫瘤活性研究

劉立新，張羽男，張強(qiáng)，張楠楠

（佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江省教育廳生物藥制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江佳木斯154007）

探究超聲輔助法提取紫花苜蓿多糖的最佳工藝，并對其進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究。利用超聲輔助提取法提取紫花苜蓿多糖；利用細(xì)胞活力測定法、LDH活性測定和雙熒光染色法研究紫花苜蓿多糖的體外抗腫瘤活性。細(xì)胞活力分析儀測定結(jié)果顯示紫花苜蓿多糖能抑制人乳腺癌細(xì)胞的活性；LDH活性測定表明紫花苜蓿多糖能影響人乳腺癌細(xì)胞并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系；雙熒光染色法結(jié)果表明紫花苜蓿多糖作用后人乳腺癌細(xì)胞凋亡數(shù)量較對照組增加；紫花苜蓿多糖具有較為良好的體外抗腫瘤活性。

紫花苜蓿；多糖；提??；抗腫瘤活性

紫花苜蓿（Medicago sativaL）是豆科（Leguminosae）苜蓿屬（Medicago）的代表性植物。由于其具有儲(chǔ)量多、營養(yǎng)價(jià)值高和易于消化等特點(diǎn)而一直作為牧草飼料在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用［1-2］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿中含有萜類、多糖及皂苷等多種具有良好抗腫瘤活性成分［3-6］。因此，將價(jià)格低廉、產(chǎn)量豐富的紫花苜蓿開發(fā)成具有高附加值藥用保健食品資源將極具現(xiàn)實(shí)意義。植物中多糖的傳統(tǒng)提取方法主要是水煎法，但提取效率較低、能耗較大。相比較而言，超聲波輔助提取法則具有效率高、能耗小、操作簡便等顯著優(yōu)點(diǎn)［7-8］。本文將延續(xù)以往的工作［9］，通過研究紫花苜?？偠嗵堑某暡ㄝo助提取工藝及其體外抗腫瘤活性，為開發(fā)紫花苜蓿中的高附加值成分提供理論參考。

1材料、試劑及儀器

1.1主要材料

原材料：紫花苜蓿，購自北京禾木青科技有限公司。

試劑：DMEM（高糖）培養(yǎng)液、優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自Gibco公司；胰蛋白酶（Sigma）購自上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品購自上海楚定分析儀器有限公司；乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸等均分析純。

1.2主要儀器

FS-20粉碎機(jī)：莊河市南甸機(jī)械廠；FA2004電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KQ-250DE型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；離心機(jī)：北京醫(yī)療儀器修理廠；HD-136超凈工作臺(tái)：哈爾濱市東聯(lián)電子儀器有限公司；LX-S50高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；Olympus IX50倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；RCO3000TVB型CO2培養(yǎng)箱：美國REVCO公司。

1.3細(xì)胞株

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。細(xì)胞株由佳木斯大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞室提供。

2方法

2.1紫花苜蓿多糖的提取

2.1.1原料的預(yù)處理

用粉碎機(jī)將紫花苜蓿干草粉碎過60目篩，備用。

2.1.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置25 mL容量瓶中，加水溶解并加至刻度，搖勻，靜置，備用。精密吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分置于具塞試管中，用蒸餾水配制成2 mL溶液，再分別加入1 mL苯酚和5 mL濃硫酸，搖勻，備用。在490 nm的波長處測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3提取方法

在單因素試驗(yàn)成功的基礎(chǔ)上確定以料液比、浸提時(shí)間、提取功率和提取溫度四因素且每因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)確定的因素水平見表1。

表1　試驗(yàn)因素水平表Table 1Table of factors and levels

通過測定紫花苜蓿供試品中的多糖的濃度，確定最佳提取工藝條件為提取時(shí)間30 min，提取溫度70℃，固液比1∶40 g/mL，頻率80 Hz。

2.1.4提取物的提取

稱取處理好的供試品10.0 g，在優(yōu)化的最佳提取工藝條件下進(jìn)行提取。提取后用紗布粗過濾，濾液趁熱抽濾。將提取液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓濃縮至相同體積后，將濾液靜置。待濾液冷卻至室溫后加入相同體積的乙醇（95%），使混合后的溶液中醇濃度達(dá)到80%以上。醇沉48 h后，將混合液通過低速離心機(jī)，以3 500 r/min離心15 min，取沉淀干燥后得粗多糖，稱量后放入冰箱備用。

2.2紫花苜蓿多糖的純化和鑒定

用蒸餾水加熱溶解粗多糖→sevage法去蛋白5次→上層溶液加2倍體積95%乙醇醇析→沉淀多糖→依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次→室溫干燥后得純紫花苜蓿多糖。

將分離純化得到的多糖純品配制成5 mg/mL的溶液進(jìn)行檢驗(yàn)。茚三酮反應(yīng)鑒別是否含氨基酸，或蛋白質(zhì)等雜質(zhì)；α-萘酚反應(yīng)鑒別是否為糖類物質(zhì)；三氯化鐵反應(yīng)鑒別是否含有酚類物質(zhì)；碘-碘化鉀反應(yīng)鑒別是否含淀粉類雜質(zhì)。

2.3樣品含量測定

精密吸取0.6 mL多糖純品置于具塞試管中，用蒸餾水配置成2 mL溶液，再分別加入1 mL苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min，然后將具塞試管放入水浴鍋中，40℃水浴加熱15 min，經(jīng)流水冷卻后。在490 nm的波長處測定吸光度。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，求出該樣品的葡萄糖濃度（mg/mL）。

結(jié)果計(jì)算：多糖含量=（C×D）/V×100%

式中：C為供試液葡萄糖濃度，（mg/mL）；D為供試液的稀釋因數(shù)；V為供試液體積，mL。

2.4體外抗腫瘤活性研究［8］

2.4.1細(xì)胞的培養(yǎng)

人乳腺癌細(xì)胞MCF-7在5%CO2和37℃的條件下，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中貼壁生長。用0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代。

2.4.2細(xì)胞活力測定

利用CASY細(xì)胞活力分析儀測定細(xì)胞活力。調(diào)整細(xì)胞密度為6×105個(gè)/mL接種于12孔培養(yǎng)板中，5% CO2和37℃條件培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入紫花苜蓿多糖使其終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL，同時(shí)設(shè)立不加紫花苜蓿多糖的對照組和加100 μg/mL的5-氟尿嘧啶組分別為陰性對照組和陽性對照組，培養(yǎng)24 h后，將12孔板內(nèi)的細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，取100 μL加入到10 mL CASY-ton緩沖液中稀釋搖勻，運(yùn)行控制面板上的START，進(jìn)行3次測量體積為400 μL的檢測。

2.4.3乳酸脫氫酶（LDH）活性的檢測

采用乳酸脫氫酶試劑盒測定：二硝基苯肼比色法。按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.4.4吖啶橙-溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色法

待細(xì)胞在12孔板中培養(yǎng)長成單層后，加紫花苜蓿多糖溶液，使其終濃度分別為100、200、400 μg/mL，同時(shí)設(shè)立空白對照著組，37℃培養(yǎng)24 h后，用胰酶消化收集細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為105個(gè)/mL，取95 μL細(xì)胞懸液加入5 μL AO/EB熒光染色液，混勻，將細(xì)胞懸液滴加到載玻片上，加蓋玻片后于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)和細(xì)胞壞死指數(shù)。

凋亡指數(shù)=［凋亡細(xì)胞數(shù)/（正常細(xì)胞數(shù)+凋亡細(xì)胞數(shù)+壞死細(xì)胞數(shù)）］×100%

3結(jié)果與討論

3.1提取物含量測定結(jié)果

3.1.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Dextrose standard sample

進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.010 4+13.52X，R=0.999 54。

3.1.2紫花苜蓿多糖的含量

在最佳提取工藝條件下，從紫花苜蓿中提取出的多糖含量為15.14 mg/g。

3.2提取物中多糖成分的鑒別結(jié)果

3.2.1α-萘酚反應(yīng)

觀察到兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)，證明提取物中含有多糖。

3.2.2茚三酮反應(yīng)

滴加茚三酮溶液，無藍(lán)色出現(xiàn)，說明所獲多糖制品不含蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，非糖蛋白形式。

3.2.3三氯化鐵反應(yīng)和碘-碘化鉀反應(yīng)

結(jié)果均呈陰性，說明提取物中不含酚類和淀粉類物質(zhì)。

3.3體外抗腫瘤結(jié)果

3.3.1紫花苜蓿多糖對乳腺癌細(xì)胞活力的影響

紫花苜蓿多糖作用24 h后，CASY細(xì)胞活力分析儀分析乳腺癌細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞活性，見表2。

表2　紫花苜蓿多糖對乳腺癌細(xì)胞活性的影響Table 2The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on activities of breast cancer cells

結(jié)果表明隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，乳腺癌細(xì)胞的數(shù)目和活性都顯著低于陰性對照組。

3.3.2乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測結(jié)果

乳酸脫氫酶（LDH）是存在細(xì)胞胞質(zhì)中的一種非特異性酶，正常情況下多存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)受外來刺激或致傷因素影響后，如細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變或受到損傷時(shí)，可大量釋放或漏出到細(xì)胞外，引起細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性增強(qiáng)，利用該特點(diǎn)將其作為細(xì)胞活性的檢測指標(biāo)，測定有毒物質(zhì)對細(xì)胞的毒性作用。本實(shí)驗(yàn)以紫花苜蓿多糖作用乳腺癌細(xì)胞24 h后，測定上清液中LDH活性，結(jié)果見表3。

表3　紫花苜蓿多糖對乳腺癌細(xì)胞LDH活性的影響Table 3The effect of polysaccharides from Medicago sativaL on LDH activity of breast cancer cells

紫花苜蓿多糖能夠增加細(xì)胞內(nèi)的LDH漏出率，隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH活性增加，試驗(yàn)組與對照組及試驗(yàn)組間比較差異均極顯著。

3.3.3吖啶橙-溴化乙錠（AO/EB）雙熒光染色結(jié)果

圖2AO/EB雙熒光染色形態(tài)學(xué)變化
Fig.2The morphological changes of AO/EB fluorescein staining

死的細(xì)胞被EB染成紅色。見圖2。

對照組可見被染成綠色的正常細(xì)胞，胞核完整，界限清晰。隨著紫花苜蓿多糖濃度的增加，具有細(xì)胞膜皺縮、染色體固縮、邊聚、碎裂等凋亡典型特征的凋亡細(xì)胞數(shù)逐漸增多，部分細(xì)胞被染成橙紅色。

4結(jié)論

本研究表明，利用超聲輔助提取法可以高效地提取紫花苜?？偠嗵恰２捎眉?xì)胞活力分析、LDH活性測定及雙熒光染色法研究紫花苜?？偠嗵求w外抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿多糖能夠抑制人乳腺癌細(xì)胞的活性并呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，人乳腺癌細(xì)胞的凋亡數(shù)量較對照組明顯增加，表明紫花苜蓿多糖具有較為良好的抗腫瘤活性。本研究為開發(fā)紫花苜蓿中的高附加值抗腫瘤成分提供了一定的理論參考。

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Study on Antitumor Activity of Polysaccharides in Vitro from Medicago sativaL

LIU Li-xin，ZHANG YU-nan，ZHANG Qiang，ZHANG Nan-nan
（School of Pharmacological Sciences，The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang，Jiamusi University，Jiamusi 154007，Heilongjiang，China）

To discuss the best ultrasonic-assisted extraction condition of the total polysaccharides from Medicago sativaL and to study the antitumor activity in vitro of total polysaccharides from Medicago sativaL. Ultrasonic-assisted extraction was employed in the extraction of the total polysaccharides from Medicago sativaL.Antitumor activity of total polysaccharides from Medicago sativaL was measured by using the cell viability assay，LDH activity and double staining immunofluorescence techniques.Cell viability assay and LDH activity measurement indicated that total polysaccharides from Medicago sativaL can dose-dependently inhibited the proliferation activity of human breast cancer cells.Double staining immunofluorescence techniques showed that human breast cancer cells apparently increased after the treatment of total polysaccharides from Medicago sativaL than the control groups.Total polysaccharides from Medicago sativaL had comparatively obvious antitumor activity in vitro.

Medicago sativaL；polysaccharides；extraction；antitumor activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.16.001

2014-06-18

國家自然科學(xué)基金（No.31101250）；黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.12521560）

劉立新（1978—），女（漢），講師，在讀博士，主要從事天然藥物活性成分研究工作。