王鵬飛，邸倩倩，劉　斌，周曉靜

（天津市制冷技術重點實驗室，天津商業(yè)大學，天津300134）

速凍速率對胡蘿卜細胞結構參數的影響

王鵬飛，邸倩倩，劉斌，周曉靜

（天津市制冷技術重點實驗室，天津商業(yè)大學，天津300134）

為研究速凍過程中不同速凍速率對果蔬細胞結構的影響，將胡蘿卜樣本分別在不同的速凍速率下進行了凍結實驗，研究比較胡蘿卜未漂燙組與漂燙處理組的細胞結冰點隨速凍速率的變化情況，并建立植物細胞圓柱體模型，還對其內壓、體積與滲透系數進行計算。結果表明：漂燙處理組樣品的細胞結冰點低于未漂燙組，細胞結冰點隨速凍速率的增大而降低；細胞體積隨細胞內壓的增大而減小，隨溫度的降低呈先增大后減小的趨勢；滲透系數總體隨凍結過程的延長而減小，其變化的激烈程度也隨凍結速率的增大而減小。

速凍速率，胡蘿卜，細胞結構，細胞體積，滲透系數

速凍是果蔬食品長期貯存的重要手段之一，我國每年速凍蔬菜的出口可創(chuàng)匯額達2億多美元，速凍水果則是生產果汁、飲品、冰淇淋等的原材料，在消費市場中占重要地位［1］。然而，速凍過程中的品質下降會導致巨大的經濟損失，原因在于其細胞結構在凍結過程中發(fā)生變化所致。因此，開展速凍期間果蔬細胞結構相關參數的研究顯得尤為重要。目前，已有部分研究學者對果蔬速凍過程中細胞組織的變化開展了若干研究。Maria Paciulli，Tommaso Ganino等［2］對蘆筍、四季豆和西葫蘆凍結過程中的組織失水及細胞壁結構變形等相關細胞結構參數的變化進行了比較研究。Sophie Chassagne-Berces等［3-4］對兩種蘋果和一種芒果分別在-20、-80℃和液氮浸泡三種條件下進行速凍，得到三種條件下質地、顏色、水分、細胞壁組成及可溶性固形物的變化，并利用低溫SEM對其細胞結冰現象進行了觀察和對比。R G M van der Sman等［5］對食品和生物材料速凍過程中的冰晶生長進行了研究，指出冰晶生長與冶金中金屬的固化非常相似。國內有樊振江、高愿軍等，晏紹慶等，以及黎繼烈等分別研究了速凍溫度以及漂燙處理工藝對獼猴桃、土豆、板栗細胞結構以及質構特性的影響［6-8］。以上研究對速凍過程中果蔬細胞形態(tài)變化和冰晶形成及生長理論提供了寶貴的素材和結論，但對細胞形態(tài)、體積、內壓與滲透系數等影響細胞結構變化的參數研究較少，且不能反映速凍過程中細胞的動態(tài)變化。本文以胡蘿卜為研究對象，通過液氮供冷冷臺對胡蘿卜細胞分別進行9種降溫速率的速凍處理，利用顯微鏡與高清攝像機記錄降溫過程中細胞組織的動態(tài)變化過程，并跟蹤單個細胞的變化情況，還對上述細胞結構參數的變化規(guī)律進行了研究，以為果蔬的貯藏加工提供相應的理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

胡蘿卜若干選取無病害、無機械損傷、大小均一的市售。

BX51型顯微鏡、Micro Publisher 5.0 RTV顯微鏡用攝像機日本奧林巴斯株式會社，傳感器Sony ICX282 Progressive Scan Interline CCD，分辨率2560× 1920@36bit；BCS196低溫臺英國Linkam Scientific Instruments，液氮降溫，溫度范圍：-196～125℃，加熱/冷凍速率：0.01～150℃/min，溫度精度：0.01℃；VT1000S型振動切片機德國Leica Biosystems，振動頻率：0～100Hz，進刀速度：0.025～2.5mm/s，振幅：0.2～1mm；DC-4006型恒溫水浴鍋寧波新芝生物科技股份有限公司，-40～100℃，±0.1℃；圖像處理軟件Image-Pro Plus和AutoCAD。

1.2實驗方法

1.2.1材料預處理選取外觀完好的新鮮胡蘿卜，用清水洗凈，用刀片切成約1cm×1cm×1cm的小立方體作為樣本。用樣本切片機將胡蘿卜樣本切成厚度為60μm的切片，將切片置于玻片作為未漂燙處理組。制取若干組樣本，在顯微鏡下觀察，選取能清晰地看到細胞完整輪廓的標本待用。取新鮮完好的胡蘿卜，用清水洗凈，切成如上樣本，后置于90℃恒溫水浴鍋中進行1min漂燙處理，其余處理步驟同上，作為漂燙處理組。

1.2.2速凍處理與圖像獲取將上述切片標本分別置于低溫顯微鏡下的冷臺內進行速凍觀察，并用顯微鏡自帶攝像機拍攝胡蘿卜細胞形態(tài)及在凍結過程中的變化情況。其中，速凍降溫速率分別選取1、3、6、9、12、15、25、50、80℃/min。

1.2.3細胞結冰溫度的獲得利用攝像機對胡蘿卜細胞的速凍過程進行拍攝時，生成的圖片自動記錄速凍時間和當前溫度。根據文獻［9］，細胞組織結冰過程會使顯微圖像明顯變暗，通過觀察細胞組織的明暗狀況可以直接判斷出結冰點溫度。

圖1　用AutoCAD獲取圓柱體細胞高徑比Fig.1　The acquisition of height-diameter ratio with AutoCAD software

1.2.4細胞體積和內壓的計算利用軟件Image-Pro Plus對上述顯微圖片進行后處理，可直接獲得顯微圖像中的細胞面積。為便于計算，通過文獻［10］對胡蘿卜細胞進行理想化假設。由Image-Pro Plus軟件可直接獲得胡蘿卜細胞的二維平面面積，利用圓柱體關系式，可分別計算出直徑D，高H，圓柱表面積A與體積V（即細胞體積）。

而對于細胞的內壓變化，假設細胞所受各向載荷均勻，那么可由文獻［11］植物細胞內壓的計算公式計算細胞內壓的變化：

其中，h—細胞壁厚度（m），0.125×10-5m；E—細胞壁彈性模量（N/m2），2.67×107N/m2；Δl—細胞周長的變化量（m）；γ—細胞壁的Poisson比，0.33；r—初始細胞半徑（m）；R—變形后細胞的半徑（m）。

由于細胞采用圓柱體模型，投影面為矩形，則對于式中的半徑R和r可采用當量直徑de來求解計算：

其中，D0—凍結過程開始時刻的細胞圓柱體直徑，H0—凍結過程開始時刻的細胞圓柱體高。p0=2× 105［11］，則可計算得出任何狀態(tài)下細胞內壓值p。

1.2.5細胞滲透系數的計算植物細胞水分傳質系數（即滲透系數）可通過下式［12］來計算：

式中，Lp—滲透系數（m/Pa·s）；A（t）—細胞膜表面積（m2）；P（t）—t時刻細胞的內壓值（Pa）；Pi—速凍過程開始時刻的細胞內壓值（Pa）—細胞排出液體的體積流量速率（m3/s）。

對各種速率下滲透系數進行多項式擬合，可得到滲透系數隨溫度的變化趨勢。另外，漂燙組因其細胞結構遭到破壞，不再進行細胞大小、內壓以及滲透系數的計算對比。

2　結果與分析

2.1速凍速率對胡蘿卜細胞形態(tài)結構的影響

分別以速凍速率為3℃/min（慢凍）和50℃/min（速凍）的胡蘿卜顯微圖片為例來說明速凍速率對胡蘿卜細胞形態(tài)結構的作用，如圖2所示。

從圖2可知，首先，凍結過程細胞圖像是一個逐漸變暗的過程（尤其是細胞間隙部分），這是由于結冰以及細胞壁邊緣發(fā)生位置變化使得光線透射發(fā)生偏折，進入目鏡的光線能量減少所致［9］；其次，不管是慢速凍結還是快速凍結，其間細胞形態(tài)結構都會發(fā)生變化（即由平坦光滑的表面變得皺縮、不規(guī)則），這是由于凍結使得細胞組織中的自由水結晶形成固體，細胞壁受力發(fā)生變化從而改變了形態(tài)；再次，不管是從圖中用線條選取的目標細胞還是從其周圍的其他細胞來看，慢速凍結相比快速凍結都會使細胞形態(tài)結構發(fā)生更大程度的變化：褶痕更深、形狀更不規(guī)則（圖2）。這是由于慢凍時，細胞間隙的水分先結冰，此時細胞內還是液態(tài)，外部冰晶結構應力作用于細胞壁，使其發(fā)生了褶皺變形；而快凍時，細胞間隙和細胞內部幾乎同時結冰，且冰晶細小，細胞壁不會發(fā)生大的形變。這與文獻［13］提出的食品凍結過程中的冰晶形成理論一致。另外，由圖中標記的時間來看，3℃/min下細胞組織凍結時間是50℃/min的11倍還多。

圖2　胡蘿卜細胞凍結過程顯微圖像Fig.2　The microscopic images of the carrot cells during frozen

圖3　速凍速率對胡蘿卜細胞組織結冰溫度的影響Fig.3　The effects of freezing rates on freezing temperatures in carrot tissues

2.2速凍速率對不同處理組胡蘿卜細胞結冰溫度的影響

由圖3可知，漂燙組和新鮮組胡蘿卜細胞速凍過程中均呈現出速凍速率越大，胡蘿卜細胞組織結冰點越低的特點。這是由于慢凍時，細胞間隙中的自由水先凍結，這使得細胞間隙水勢下降，導致細胞內自由水滲出到細胞間隙中。形成冰晶的過程中，由于慢凍時溫度梯度較小，再加上相變釋放出的潛熱使凍結過程溫度下降緩慢，在這個緩慢的相變過程中伴隨著細胞內水分不斷地滲出，滲出的水分繼續(xù)結晶，這樣就在細胞間隙形成較大冰晶，而且形成冰晶的溫度偏高。而快速凍結時，由于溫度梯度很大使得相變潛熱的影響變得相對微弱，此時細胞組織內冰晶推進速度非?？?，水分來不及向細胞外擴散就在細胞內迅速形成了細小的冰晶，速凍時形成冰晶的溫度相對較低［14］。漂燙處理是果蔬貯存的一種常用預處理方式，主要用來滅菌和抑制PPO、POD酶的活性，從而減少貯存過程中營養(yǎng)成分的損失［15］。但由于漂燙會導致細胞失活，所以會影響細胞組織的結冰。從圖3可以看出，漂燙組細胞組織的結冰點明顯低于新鮮胡蘿卜細胞組織的結冰點，約低5～10℃。可能由于漂燙組經高溫漂燙處理后細胞膜破裂［16-17］，失去選擇透過性，原生質內水分、無機鹽和有機物等成分流出細胞［18］，進入細胞間隙，導致細胞間隙內的液體濃度比新鮮組高，從而降低了細胞組織結冰點，結果出現了圖中漂燙組細胞組織的結冰點要低于新鮮組細胞組織的結冰點的現象。圖4給出了新鮮果蔬（蘆筍）細胞組織和經漂燙（90℃，30s）處理后的細胞組織的對比。由圖可知，新鮮組細胞圓潤飽滿，而漂燙組細胞大部分都已坍縮、變形，有相當一部分細胞體積嚴重萎縮，細胞形狀呈現出條狀或點狀。這些現象更加驗證了高溫漂燙會導致細胞膜破損，引起原生質成分外流，從而為漂燙組細胞組織結冰點更低提供了證據。

圖4　蘆筍莖橫斷面：新鮮細胞組織（A）和漂燙處理后的細胞組織（B）［2］Fig.4　Transverse sections of asparagus stem samples：A.raw；B.blanched［2］

2.3速凍速率對不同處理組細胞內壓與體積的影響

根據前述細胞體積V和細胞內壓p的計算方法可得出細胞內壓和體積之間的變化關系，現選取降溫速率分別為6、12、15、80℃/min的過程為例，分別如圖5（a、b、c、d）所示。

由圖5（a、b、c、d）可以看出，胡蘿卜細胞體積大體上隨速凍過程的進行先略增大后減小，且在-10～0℃之間細胞體積出現最大值；而細胞內壓的變化則與細胞體積的變化趨勢恰恰相反，即體積隨內壓增大而減小。這種現象的出現，推測是由于凍結過程進行到0℃以下時，水發(fā)生相變結冰，結冰后的體積約為液態(tài)水體積的10/9倍，因此會出現體積增大現象；然而體積最大值點不在0℃這一點，一是因為細胞液和細胞間隙的組織液濃度高于純水使得結冰溫度要低于0℃，二是因為凍結過程存在過冷現象。而隨后體積急速減小的現象，可能是由細胞組織水分結晶導致細胞壁所受應力變化，以及內壓激增引起水分滲出細胞的共同作用，使得細胞框架坍縮所致。Naiqiang Wu等［12］提出蘋果薄壁組織細胞的體積在1.2×106μm3左右，細胞初始內壓（即在沒有施加載荷的情況下）為200kPa，且細胞實際內壓與所受載荷符合胡克定律。文獻［19］在研究了10種常見的甲藻類細胞體積后，指出常見甲藻體積介于2.97×102～4.5×104μm3之間。本文所得細胞體積范圍大致處于0.8×10-13～4.0×10-13m3（即0.8×105～4.0×105μm3）之間，內壓初始值及采用的計算方法均來自文獻［11］?？紤]到植物品種不同、細胞種類不同（薄壁組織細胞以具有大液泡著稱，體積較大），因此計算所得細胞體積和內壓在合理范圍內。

2.4速凍速率對不同處理組細胞滲透系數的影響

現選取速凍速率分別為6、12、15、80℃/min的新鮮胡蘿卜細胞滲透系數變化趨勢圖為例，分別如圖6（a、b、c、d）所示。

圖5　速凍過程中胡蘿卜細胞內壓與體積的變化關系Fig.5　The tugor pressure and volume changes of carrot cell during frozen

圖6　凍結過程中胡蘿卜細胞滲透系數的變化Fig.6　The permeability changes of carrot cells during frozen

由圖6（a、b、c、d）的擬合曲線可以看出，滲透系數大體上隨著速凍過程的進行而降低；在速凍過程進行的后半段：滲透系數發(fā)生波動；且速凍速率越小波動越激烈，速凍速率越大波動越平緩。造成這種結果的原因除了誤差之外可能是由于凍結的后半段是結冰過程：快凍（80℃/min）時，細胞內外在短時間內基本同時結冰，所以滲透系數基本不變。而慢速凍結時，細胞外先形成冰晶水分減少，使得細胞內滲透系數為負，向外滲水；而此時細胞外部本身形成的冰晶溫度就比較高，隨著細胞內水分的滲出，胞外冰晶吸收滲出水的能量，有可能變?yōu)橐簯B(tài)水，與此同時，細胞內由于向外滲水濃度升高，具有吸水能力，滲透系數為正，如果此時凍結速率足夠慢，胞間水分理論上會再次進入細胞。上述過程經過反復幾次，直至最終細胞內外完全凍結為止，從而呈現出圖中6、12、15℃/min速凍速率下的變化特點。以上理論分析與文獻［20］中所述細胞凍結過程中有關水分滲透的“IIF”模型一致。按照上述理論，最終凍結點滲透系數為0，此時凍結過程已結束，細胞內外不再發(fā)生滲流現象。本文計算得出的滲透系數變化范圍的數量級總體分布在10-8～10-6之間，考慮到細胞種類和大小的不同以及本實驗施加了凍結過程，對比E Dintwa等［21］給出的細胞滲透系數2×10-9以及Wang等［22］給出的10-8～2×10-5范圍內的滲透系數來說，本文滲透系數的計算在合理范圍之內。

3　結論

3.1慢凍與快凍都會使細胞形態(tài)結構發(fā)生變化，但慢凍較快凍會使細胞形態(tài)結構發(fā)生更大程度的變化，呈現出褶痕加深、形狀更不規(guī)則的特點。

3.2漂燙組和新鮮組細胞組織結冰點都隨凍結速率的增大而降低，但由于漂燙組細胞膜遭高溫破壞失去選擇透過性，汁液流入細胞間隙，使得細胞間隙溶液濃度上升，從而使漂燙組細胞組織結冰點整體低于新鮮組5～10℃。

3.3隨著凍結過程的進行，細胞體積先增大后減?。患毎w積的最大值出現在0～-10℃之間，與過冷度相關；細胞體積變化范圍分布在0.8×10-13～4.0×10-13m3之間；內壓的變化則與體積的變化相反內壓基本在200kPa附近變化，變化幅度不大。

3.4滲透系數隨凍結過程的進行而降低；結冰期間，滲透系數在慢凍時變化劇烈，快凍時基本不變，最終都趨于0；計算所得的胡蘿卜細胞速凍過程中的滲透系數變化的數量級在10-8～10-6之間。

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Effect of freezing rate on some structural parameters of carrot cells

WANG Peng-fei，DI Qian-qian，LIU Bin，ZHOU Xiao-jing
（Tianjin Key Lab of Refrigeration Technology，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

In order to study the effect of different freezing rates on the cell structure of fruits and vegetables，the carrot tissue samples were selected and frozen under different freezing rates respectively.For both of the blanched and fresh carrot tissue，the relationship between the freezing temperatures and the freezing rates was studied.A cylindrical model for plant cell was established.With this model，the cell volume，turgor pressure and permeability coefficients were calculated.The results showed that the freezing temperatures of the blanched carrots were lower than that of the fresh ones，and the freezing temperatures decreased with the increase of the freezing rates，the cell volume decreased as the turgor pressure rose，and the development tendency of the volume increased at first，then decreased when the temperature dropped.As for the permeability coefficient，it decreased with prolonged freezing process and its changing amplitude also decreased as the freezing rates increased.

freezing rate；carrot；cell structure；cell volume；permeability coefficient

TS255.1

A

1002-0306（2015）10-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.017

2014－09－10

王鵬飛（1989-），男，碩士研究生，研究方向：冷鏈過程中的熱質傳遞及強化。

天津市科技支撐項目（14ZCZDNC00016）；教育部重點基礎研究資助項目（21109）。