曹玉林，束天鋒，劉艷玲，薛秀恒，梅　林，王志耕，孫郭艷

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

牛奶中三種糖醇類甜味劑的氣相色譜測(cè)定及前處理方法研究

曹玉林，束天鋒，劉艷玲，薛秀恒*，梅林，王志耕，孫郭艷

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品加工工程實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230036）

利用冷凍干燥處理與毛細(xì)管氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定牛奶中的糖醇類甜味劑。牛奶用乙酸鋅和氫氧化鋇除去蛋白質(zhì)后，經(jīng)冷凍干燥，樣品中的糖醇與吡啶-乙酸酐（1∶1，v/v）于90℃反應(yīng)30min，生成的糖醇乙酰酯衍生物經(jīng)HP-5毛細(xì)管柱色譜分離，氫火焰離子化檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明：與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)相比，冷凍干燥處理樣品的回收率更高。在優(yōu)化的色譜條件下，本方法在10～90μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9974～0.9999），重復(fù)性好（RSD=1.37%～2.04%），平均加標(biāo)回收率在91.17%～92.06%之間。該方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，適用于牛奶中糖醇類甜味劑含量的測(cè)定。

牛奶，糖醇，冷凍干燥，氣相色譜

在人類眾多的食品中，乳占有特殊的地位［1］。通常牛乳中蛋白質(zhì)含量約為3.5%，是人類蛋白質(zhì)的主要來源之一［2］，而且牛乳中還含有微量的糖醇如赤蘚糖醇、甘露糖醇等［3-4］。中國(guó)現(xiàn)有9240萬糖尿病患者［5］，齲齒和肥胖癥患者也在逐年增加［6］，而糖醇在人體代謝過程中具有多種功能特性［7］，在消化過程中，部分糖醇進(jìn)入大腸，被腸內(nèi)有益菌利用，只產(chǎn)生很低的熱量［8］。糖醇不宜作為口腔微生物的營(yíng)養(yǎng)源，長(zhǎng)期攝入不會(huì)引起牙齒齲變［9］，同時(shí)糖醇在人體內(nèi)的代謝途徑與胰島素?zé)o關(guān)，不會(huì)引起血糖和血中胰島素水平波動(dòng)，可用作糖尿病患者的特定食品［10］。因此，糖醇1類強(qiáng)化型牛奶正在成為乳品工業(yè)一種新的發(fā)展趨勢(shì)［11］。

目前牛奶中糖醇類甜味劑檢測(cè)方法較單一，主要采用配備蒸發(fā)光散射檢測(cè)器［12］、二極管陣列檢測(cè)器［13］、示差折光檢測(cè)器［14］的高效液相色譜儀，分析速度慢，而氣相色譜法高效、快速，為此，本實(shí)驗(yàn)研究了牛奶中糖醇含量的氣相色譜測(cè)定方法，并對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)去除試劑進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)為保護(hù)色譜柱填充料和方便乙酰化處理，對(duì)比了兩種干燥方法，為今后牛奶中糖醇類甜味劑的分析檢測(cè)提供方法選擇依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

標(biāo)準(zhǔn)阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇江萊試劑有限公司，純度99.5%；氫氧化鋇、硫酸鋅、三氯乙酸西隴化工股份有限公司，分析純；丙酮、吡啶、乙酸酐國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，分析純；純牛奶南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司。

Agilent7890B型氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司；HH-S型恒溫水浴鍋江蘇國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；Allegra-64R型BECKMAN離心機(jī)美國(guó)貝克曼公司；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海申勝生物技術(shù)有限公司；MS105DU型梅特勒-托利多電子天平德國(guó)梅特勒-托利多公司；FD-1CE型冷凍干燥機(jī)北京德天佑科技有限公司；10μL微量進(jìn)樣器上海光正醫(yī)療儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1三種糖醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)品各4mg（精確至0.01mg）于3個(gè)10mL容量瓶中，分別加入2mL吡啶，2mL乙酸酐，90℃下水浴30min，間歇振蕩，使之乙?；?，取出冷卻后，加丙酮定容，得到各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.4mg/mL的儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確吸取0.25mL三種糖醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液置10mL容量瓶中，用丙酮定容得到三種糖醇濃度分別為10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并依照此方法配制30、50、70、90μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，立即進(jìn)行氣相色譜分析，以峰面積（X）對(duì)相應(yīng)糖醇的濃度（Y）進(jìn)行線性回歸分析。

1.2.2三種糖醇乙?；瘲l件的確定當(dāng)吡啶-乙酸酐（1∶1，V/V）時(shí)，以反應(yīng)溫度為70、80、90、100℃，反應(yīng)時(shí)間為20、30、40、50min，進(jìn)行三種糖醇乙?；?5］條件的組合實(shí)驗(yàn)。

1.2.3樣品的前處理

1.2.3.1樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別稱取阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇標(biāo)準(zhǔn)品9mg（精確至0.01mg）于100mL容量瓶中，用純水溶解定容成三種糖醇濃度分別為90μg/mL的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，供加標(biāo)法進(jìn)行蛋白質(zhì)去除試劑和干燥方法對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2樣品的制備移取10mL純牛奶于150mL燒杯中，加入3mL 1.2.3.1制備的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到分別加有270μg三種標(biāo)準(zhǔn)品的樣品。分別加入5mL 0.3%硫酸鋅溶液和0.3%氫氧化鋇溶液，反應(yīng)0.5h，將樣液全部轉(zhuǎn)移至離心管中，以10000r/min離心10min，得上清液。

1.2.3.3樣品的干燥旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的樣液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下旋蒸至近干；將上清液全部轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，在-20℃預(yù)凍3h，利用冷凍干燥機(jī)在-50℃下冷凍干燥12h。

1.2.3.4樣品的衍生向干燥后的樣品中加入2mL吡啶，2mL乙酸酐，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿，然后搖勻，90℃下水浴30min，間歇搖晃，使之乙?；?5］。反應(yīng)完畢后冷卻至室溫，經(jīng)0.45μm有機(jī)相濾膜過濾后，立即進(jìn)行氣相色譜分析，以保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.2.4色譜條件色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管柱（30m× 320μm×0.25μm，美國(guó)Agilent公司）；進(jìn)樣口溫度：270℃；柱溫：初始溫度170℃，保留2min，以10℃/min升至220℃，保留2min，再以10℃/min升至270℃，保留10min；檢測(cè)器溫度：280℃；載氣：高純氮，恒流模式：1.2mL/min；尾吹氣：45mL/min；分流比：40∶1；進(jìn)樣量：1μL。

1.2.5檢出限及精密度實(shí)驗(yàn)吸取10mL牛奶，加入3mL 90μg/mL樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3進(jìn)行樣品前處理，平行進(jìn)樣6次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差以評(píng)價(jià)方法的精密度；以樣品中能檢出糖醇的最低添加量為檢出限。

1.2.6回收率及重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密吸取3mL 90μg/mL樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到10mL牛奶中，按1.2.3進(jìn)行樣品前處理，平行實(shí)驗(yàn)6次，對(duì)方法的回收率和重現(xiàn)性進(jìn)行考察。

2　結(jié)果與討論

2.1三種糖醇乙酰化條件的確定

按1.2.2，考察了不同反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)糖醇衍生化效果的影響。結(jié)果表明：三種糖醇衍生產(chǎn)物的峰面積隨著乙?；磻?yīng)溫度的升高、時(shí)間的增加而增加，當(dāng)吡啶-乙酸酐（1∶1，V/V），反應(yīng)溫度為90℃，反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，三種糖醇衍生產(chǎn)物的峰面積趨于最大值，反應(yīng)基本完全，產(chǎn)物較單一，準(zhǔn)確度高，因此確定為最終衍生化條件。

2.2色譜條件的優(yōu)化

為了確定色譜分離條件，實(shí)驗(yàn)比較了極性色譜柱：DB-FFAP（15m×250μm×0.25μm）和弱極性色譜柱：HP-5（30m×320μm×0.25μm）對(duì)三種糖醇衍生產(chǎn)物的分離效果。結(jié)果表明：DB-FFAP柱分離糖醇衍生物時(shí)，色譜峰不對(duì)稱，分離度和重現(xiàn)性較差，影響定量，而HP-5柱能較好地將糖醇衍生物分離，重現(xiàn)性好，靈敏度較高（圖1），所以本實(shí)驗(yàn)采用HP-5柱進(jìn)行檢測(cè)。

圖1　糖醇標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.1　GC chromatogram of sugar alcohol standards

2.3前處理方法的優(yōu)化

2.3.1蛋白質(zhì)去除試劑濃度與添加量的選擇實(shí)驗(yàn)分析了蛋白質(zhì)去除試劑不同質(zhì)量百分濃度與添加量對(duì)蛋白質(zhì)沉淀效果的影響。結(jié)果（表1）表明：當(dāng)試劑濃度為0.1%時(shí)，隨著試劑添加量的增加，即試劑與牛奶體積比的增加，上清液未完全澄清。而當(dāng)試劑濃度為0.3%、試劑與牛奶體積比為1∶1時(shí)，上清液已澄清，沉淀效果較好，便于乙?；幚?，從對(duì)牛奶中成分影響角度考慮，確定試劑濃度為0.3%，試劑與牛奶體積比為1∶1。

表1　蛋白質(zhì)去除試劑不同濃度與添加量組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　Combination experiments of different concentration and adding quality of protein removal reagents

2.3.2蛋白質(zhì)去除試劑的選擇分別添加了270μg三種糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的樣品經(jīng)鋅鹽和鋇鹽與經(jīng)三氯乙酸兩種方法處理后測(cè)得的譜圖如圖2和圖3所示，平均加標(biāo)回收率如圖4所示。

圖2和圖3表明：兩種方法都能凈化樣品，但加入與三氯乙酸同等濃度和體積的鹽溶液沉淀效果更好，同時(shí)鋅鹽和鋇鹽對(duì)牛奶中成分的影響小于三氯乙酸，提高了樣品的回收率。由圖4看出，經(jīng)兩種方法處理后，阿拉伯醇、木糖醇平均加標(biāo)回收率差異極顯著（p＜0.01），通過鹽處理的加標(biāo)樣品中糖醇回收率高于三氯乙酸處理的加標(biāo)樣品，其中木糖醇平均回收率相差7.10%。且三氯乙酸易潮解，不易定量稱量，綜合考慮鹽處理效果優(yōu)于三氯乙酸處理。

2.3.3樣品干燥方法的選擇分別添加了270μg三種糖醇標(biāo)準(zhǔn)品的樣品經(jīng)冷凍干燥與經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)兩種方法處理后測(cè)得的譜圖如圖5和圖6所示，平均加標(biāo)回收率如圖7所示。

圖2　加鹽樣品氣相色譜圖Fig.2　GC chromatogram by salt

圖3　加三氯乙酸樣品氣相色譜圖Fig.3　GC chromatogram by acetocaustin

圖4　兩種蛋白去除方法的平均加標(biāo)回收率Fig.4　The average recoveries of two kinds of protein removal methods

圖5　冷凍干燥氣相色譜圖Fig.5　GC chromatogram by freeze-drying

圖6　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)氣相色譜圖Fig.6　GC chromatogram by rotary evaporation

圖7　兩種干燥方法的平均加標(biāo)回收率Fig.7　The average recoveries of two kinds of drying methods

圖5和圖6表明：經(jīng)過兩種干燥方法處理，峰面積差別明顯，冷凍干燥后樣品中糖醇的濃度高于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理的樣品。由圖7看出，經(jīng)冷凍干燥處理的樣品中，三種糖醇平均加標(biāo)回收率均高于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理的樣品（p＜0.01），其中木糖醇回收率相差11.09%。糖醇水溶性較好［8］，在水劇沸的同時(shí)，糖醇流失速度加快，回收率降低，而冷凍干燥在低溫下將水分升華，且冷凍干燥可以批量處理樣品，減小了誤差，更適用于前處理中樣品的干燥。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性方程、檢出限及精密度的測(cè)定按1.2.1，進(jìn)行線性回歸分析，得3種標(biāo)準(zhǔn)品的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍；按1.2.5考察方法的檢出限及精密度。結(jié)果（見表2）表明：精密度實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.23%～2.12%之間，表明該方法具有較好的精密度。

2.4.2回收率及重現(xiàn)性的測(cè)定參照未加標(biāo)準(zhǔn)品牛奶中糖醇的含量水平，經(jīng)檢測(cè)，10mL牛奶空白樣中阿拉伯醇、木糖醇未檢測(cè)到，甘露糖醇含量為10.08μg。按1.2.6考察方法的回收率及重現(xiàn)性。結(jié)果（見表3）表明：三種糖醇回收率在91.17%～92.06%之間，表明氣相色譜能較好測(cè)定糖醇的含量，但是由于在蛋白質(zhì)沉淀和樣品干燥過程中，少量糖醇隨著蛋白質(zhì)沉淀和水分的升華出現(xiàn)一定的損失，導(dǎo)致方法存在一定的系統(tǒng)性偏差，需要進(jìn)一步研究；重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.37%～2.04%之間，表明此方法具有較好的重現(xiàn)性。

表2　糖醇的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和精密度Table 2　Linear equations，correlation coefficients，linear ranges，detection limits and precisions of sugar alcohols

表3　回收率和重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)Table 3　Average recovery and reproducibility of measured results

3　結(jié)論

確立了衍生化時(shí)間及溫度、色譜分離條件，以乙酸鋅和氫氧化鋇除去牛奶中蛋白質(zhì)，經(jīng)冷凍干燥，利用毛細(xì)管氣相色譜定量分析糖醇類強(qiáng)化型牛奶中阿拉伯醇、木糖醇、甘露糖醇的方法。研究結(jié)果表明該方法具有良好的精密度和重復(fù)性，操作簡(jiǎn)單，適于分析糖醇類強(qiáng)化型牛奶中糖醇類甜味劑的含量，為以后牛奶中糖醇的檢測(cè)分析提供方法和理論依據(jù)。

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Study on pretreatment methods for the simultaneous determination of three kinds of sugar alcohols in milk by gas chromatography

CAO Yu-lin，SHU Tian-feng，LIU Yan-ling，XUE Xiu-heng*，MEI Lin，WANG Zhi-geng，SUN Guo-yan
（College of Tea and Food Science and Technology of Anhui Agricultural University，Anhui Agricultural Products Processing Engineering Laboratory，Hefei 230036，China）

A novel method was developed for the determination of sugar alcohol contents in milk by gas chromato-graphy after freeze-drying，and the external standard method was used to determine.After removal of proteinby zinc sulphate and barium hydroxide，the freeze-drying was used to dry samples.The sugar alcohols reacted withpyridine-acetic anhydride（1∶1，v/v）at 90℃ for 30min.The sugar alcohol acetate derivatives were analyzed by gas chromatography with HP-5（30m×320μm×0.25μm）and with a flame ionization detector.The results showed that the recoveries of sugar alcohols treated by freeze-drying was higher than rotary evaporation.Under the optional chromatographic conditions，the calibration curve was linear in the range of 10～90μg/mL（r=0.9974～0.9999）.The repeatability was reproducible（RSD=1.37%～2.04%）.The average recoveries were between 91.17%and 92.06%.This method was simple and fast so that it could be used to determine sugar alcohol contents in milk.

milk；sugar alcohols；freeze-drying；gas chromatography

TS252.7

A

1002-0306（2015）10-0069-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.005

2014－08－14

曹玉林（1990-），男，在讀碩士研究生，研究方向：動(dòng)物性食品加工與安全檢測(cè)。

薛秀恒（1971-），男，博士，副教授，研究方向：動(dòng)物性食品加工與安全檢測(cè)。

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（11040606M91）；安徽省實(shí)驗(yàn)區(qū)和試點(diǎn)省專項(xiàng)基金項(xiàng)目（12z0102055）。