陳利紅 李麗麗 高利芬 周俊飛 李甜甜 彭海

（江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院，武漢 430056）

萊茵衣藻BBS1基因RNAi載體的構(gòu)建及應(yīng)用

陳利紅 李麗麗 高利芬 周俊飛 李甜甜 彭海

（江漢大學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué)研究院，武漢 430056）

巴德-畢氏綜合癥（Bardet-Biedl syndrome，BBS）是一種由多種基因突變?cè)斐?、與原生纖毛功能缺失相關(guān)的疾病，包含12種致病基因，分別為BBS1-12。旨在通過(guò)對(duì)衣藻BBS1基因進(jìn)行RNAi干擾來(lái)研究其在衣藻中的功能。首先搭建衣藻快捷簡(jiǎn)單的RNAi骨架載體；再用RT-PCR克隆萊茵衣藻BBS1基因的一段cDNA 序列于中間載體pEASY-T1上；測(cè)序后通過(guò)兩次酶切連接到RNAi骨架載體上，經(jīng)菌液PCR、酶切和測(cè)序驗(yàn)證，成功構(gòu)建BBS1基因的RNAi干涉載體。經(jīng)基因槍介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC503，轉(zhuǎn)基因衣藻具有明顯不同于對(duì)照的表現(xiàn)型，趨光性發(fā)生了改變。

萊茵衣藻；RNAi載體；BBS1 基因；趨光性

萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）屬于綠藻門(mén)、團(tuán)藻目、衣藻科，是真核單細(xì)胞生物。進(jìn)化上比較古老，介于高等植物和動(dòng)物之間。衣藻的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、光合效率高、遺傳背景清楚，是重要的能源作物，素有“綠色酵母”之稱［1］。其生物學(xué)特性與高等植物和動(dòng)物密切相關(guān)，如纖毛病理學(xué)［2］，是目前用于研究纖毛的模式生物中最為廣泛使用的一個(gè)［3］。

近年來(lái)，人們關(guān)于纖毛的知識(shí)大多來(lái)自于對(duì)萊茵衣藻的研究，如我們對(duì)纖毛結(jié)構(gòu)的了解，“鞭毛內(nèi)運(yùn)輸”的機(jī)制的發(fā)現(xiàn)以及與纖毛相關(guān)疾病的確定等［3］。其中，巴德-畢氏綜合癥（Bardet-Biedl syndrome，BBS）就是一種由多種基因突變?cè)斐?、與原生纖毛功能缺失相關(guān)的疾病。包含12種致病基因，分別為BBS1-12［4，5］。BBS患者的癥狀包括視網(wǎng)膜衰退、腎囊形成、多指（趾）癥、嗅覺(jué)失敏、高血壓、肥胖癥乃至精神發(fā)育遲滯癥等［5］。最近的研究發(fā)現(xiàn)BBS蛋白位于纖毛或基體，它們參與了纖毛的組裝過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程［6］。在萊茵衣藻中，抑制BBS5的表達(dá)，纖毛將不能形成［6］；BBS1或BBS4基因突變的萊茵衣藻喪失趨光性［4］，但是其失去趨光性的分子機(jī)制尚不清楚，有待人們進(jìn)一步深入研究。

2007年萊茵衣藻基因組測(cè)序的完成為萊茵衣藻反向遺傳學(xué)的研究提供了可能。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象［7，8］。它是一種高效的特異性強(qiáng)的基因阻斷技術(shù)，近年來(lái)發(fā)展迅速，目前已成為功能基因組研究領(lǐng)域中一種簡(jiǎn)單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，在一定程度上起到了基因Knock-down的效果［9，10］。因此若用RNAi技術(shù)對(duì)衣藻BBS1進(jìn)行研究，將會(huì)促進(jìn)人們深刻了解和認(rèn)識(shí)萊茵衣藻趨光性的分子機(jī)制，同時(shí)有可能揭示出“纖毛相關(guān)疾病”發(fā)生的分子機(jī)理，為BBS1基因功能的進(jìn)一步揭示及衣藻趨光性分子機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試材萊茵衣藻CC503，購(gòu)自于美國(guó)Duke大學(xué)衣藻中心。藻株接種到固體TAP（Tris-Acetate-Phosphate）平板上進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

菌株大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。pEASY-T1 Cloning Kit購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司，中間載體pChlamy_3載體質(zhì)粒購(gòu)自于Invitrogen公司。反轉(zhuǎn)錄試劑及各種內(nèi)切酶購(gòu)自于NEB公司，各種Taq聚合酶購(gòu)于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 衣藻RNAi骨架載體的搭建

1.2.1.1 pGH-intron中間載體的構(gòu)建 利用CTAB 法提取萊茵衣藻基因組DNA，以其為模板，根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的磷酸核酮糖激酶（Phosphoribulokinase）序列信息（GenBank登錄號(hào)：AAA33090.1），設(shè)計(jì)一對(duì)引物PRF1：5'-GTGAGCAAGAGATGCGGC-3'，PRR1：5'-CTGGTGGGGAGGAGGGAG-3'，PCR擴(kuò)增其第4段內(nèi)含子，連接到pEASY-T1載體，并進(jìn)行測(cè)序，獲得磷酸核酮糖激酶的第4段內(nèi)含子序列，即間隔序列。將設(shè)計(jì)好的兩端帶有合適多克隆位點(diǎn)的間隔序列委托捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成，并構(gòu)建到由該公司提供的pGH載體上，形成中間載體pGH-intron。

1.2.1.2 pChlamy_RNAi骨架載體的構(gòu)建 以pGH-intron為載體的基本骨架，利用PCR技術(shù)設(shè)計(jì)4條引物分別擴(kuò)增pChlamy_3載體上的啟動(dòng)子序列，引物 為HSPF1：5'-AACTGCAGTCGCTGAGGCTTGACATG-3'（下劃線部分為PstⅠ酶切位點(diǎn)）與HSPR1：5'-GGGGTACCTTTAAGATGTTGAGTGACTTC-3'（下劃線部分為KpnⅠ酶切位點(diǎn)）；擴(kuò)增含有終止子（3'UTR）和潮霉素標(biāo)記完整表達(dá)框序列，引物為UTRHYGF1：5'-GCTCTAGACCGCTCCGTGTAAATGGA-3'（下劃線部分為XbaⅠ酶切位點(diǎn)）與UTRHYGR1：5'-AGAATGCGGCCGCAGTACCATCAACTGACG-3'（下劃線部分為NotⅠ酶切位點(diǎn)）；擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后相繼插入到pGH-intron的多克隆位點(diǎn)之間，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，從而形成衣藻的RNAi骨架載體，命名為pChalmy-RNAi載體。

1.2.2 BBS1基因干涉片段的獲得 為確認(rèn)cDNA選取片段對(duì)BBS1基因干擾效果的影響，選取了BBS1基因上的兩段序列進(jìn)行干擾，克隆出來(lái)的片段分別命名為BBS1.1和BBS1.2。具體方法如下：TRIzoL提取萊茵衣藻總RNA，并用M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。然后再以合成的cDNA為PCR模板，用BBS1.1F與BBS1.1R引物對(duì)及BBS2.1F與BBS2.1R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到pEASY-T1載體上并測(cè)序，形成pEASY-T1-BBS1.1/2.1中間載體，獲得BBS1基因兩段干涉片段BBS1.1和BBS2.1。 其中克隆BBS1基因上這兩段序列所用的引物如下：

BBS1.1F：5'-GCTCTAGAGGGGTACCAGTCCAACCCAAACGATTAC-3'（下劃線部分分別為XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)）；BBS1.1R：5'-GATTCCATATGGACTAGTGTCGCCAAACAGATTACAAG-3'（下劃線部分分別為NdeⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)）；BBS2.1F：5'-GCTCTAGAGGGGTACCCGGGCGTATGTCAAGGTC-3'（下劃線部分分別為XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)）；BBS2.1R：5'-GATTCCATATGGACTAGTGCACCAGGAAGGGTATCG-3 '（下劃線部分分別為NdeⅠ和SpeⅠ酶切位點(diǎn)）。

帶總苞菩提子卵圓形,長(zhǎng)7-10毫米,直徑6-8毫米,琺瑯質(zhì),堅(jiān)硬,有光澤,按壓不破,有白、灰、藍(lán)紫等各色,基端之孔大,易于穿線成串。但其穎果小,含淀粉少,常不飽滿.一般不做藥或食用。此種疑似民間所稱草珠子。

1.2.3 BBS1基因 RNAi載體的構(gòu)建 酶切含有BBS1基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1/2.1中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)KpnⅠ和SpeⅠ酶切的pChlamy_ RNAi骨架載體連接，獲得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F 中間載體。

酶切含有BBS1基因反向目的片段的pEASYT1-BBS1.1/2.1中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)NdeⅠ和XbaⅠ酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F 中間載體連接，獲得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_ RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi載體。

1.2.4 BBS1基因RNAi載體的轉(zhuǎn)化與篩選 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的無(wú)細(xì)胞壁的萊茵衣藻CC503，用基因槍方法轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后在弱光下培養(yǎng)2 d后，將固體平板上的萊茵衣藻轉(zhuǎn)移至含10 mg/L潮霉素的50 mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，培養(yǎng)7-10 d直至液體培養(yǎng)基中綠色完全褪去，再取2 mL涂在固體平板上進(jìn)行固體篩選（10 mg/L hygromycin），7 d左右長(zhǎng)出單克隆，挑單克隆至液體培養(yǎng)。

1.2.5 Real-time PCR分析BBS1基因的沉默效果分別提取CC503野生型及轉(zhuǎn)pChlamy_RNAi_BBS1.1/ 2.1_FR質(zhì)粒的萊茵衣藻總RNA。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后以其為Real-time PCR的模板；S26 RNA作為內(nèi)參［11］，進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。檢測(cè)野生型及轉(zhuǎn)pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR質(zhì)粒的萊茵衣藻中目標(biāo)基因mRNA的表達(dá)變化，以確定對(duì)目標(biāo)基因的干擾效果。所用內(nèi)參及靶基因引物對(duì)如下：S26F：5'-CGCCCTGCCCAAGATTTA-3'；S26R：5'-CGCGGCTGTGGATAGCA-3'；BBS1QF：5'-GGGCGTATGTCAAGGTC-3'；BBS1QR5：5'-GCACCAGGAAGGGTATCG-3'。

1.2.6 萊茵衣藻趨光性分析 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型CC503及轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻于培養(yǎng)皿中，然后用錫箔紙包嚴(yán)，只留一定大小的空隙以便光源射入，2 h后觀察兩株系萊茵衣藻的趨光性變化。

2 結(jié)果

2.1 衣藻RNAi骨架載體的搭建

利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增了衣藻磷酸核酮糖激酶蛋白的第4段內(nèi)含子，然后連接到pEASY-T1載體，并進(jìn)行測(cè)序，大小為497 bp（圖1）。在該段序列兩端設(shè)計(jì)合適的多克隆酶切位點(diǎn)，委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成，并構(gòu)建到由該公司提供的pGH載體上，形成中間載體pGH-intron。

圖1 萊茵衣藻磷酸核酮糖激酶第4段內(nèi)含子的PCR產(chǎn)物

利用PCR技術(shù)，設(shè)計(jì)合適的含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，分別擴(kuò)增Invitrogen公司pChlamy_3載體上的啟動(dòng)子序列及含有終止子和潮霉素標(biāo)記完整表達(dá)框序列（圖2），PCR產(chǎn)物酶切后相繼連接到中間載體pGH-intron上，并測(cè)序驗(yàn)證，形成衣藻RNAi載體的基本骨架，命名為pChalmy-RNAi載體（圖3）。

圖2 萊茵衣藻啟動(dòng)子和3'UTR與潮霉素表達(dá)框序列的PCR產(chǎn)物

2.2 BBS1基因干涉片段的獲得

根據(jù)phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)公布的BBS1基因（g17944.t1）報(bào)道的序列，設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物分別擴(kuò)增BBS1基因上兩段序列，然后連接到pEASY-T1載體，并進(jìn)行測(cè)序形成pEASY-T1-BBS1.1/2.1中間克隆載體，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為188 bp和229 bp，結(jié)果與預(yù)期大小一致（圖4）。另外，由于我們?cè)O(shè)計(jì)的每條引物上均含有正向插入位點(diǎn)和反向插入位點(diǎn)合適的酶切位點(diǎn)，因此中間載體pEASY-T1-BBS1.1/2.1上相當(dāng)于既含有靶基因的正向片段序列又含有反向片段序列，因此無(wú)需再進(jìn)行反向片段的克隆，節(jié)省了構(gòu)建時(shí)間和實(shí)驗(yàn)成本。

圖3 衣藻RNAi骨架載體構(gòu)建示意圖

圖4 BBS1基因干涉片段的PCR擴(kuò)增

2.3 BBS1基因RNAi載體的構(gòu)建

用KpnⅠ和SpeⅠ 酶切含有BBS1基因正向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1/2.1中間載體，然后與同樣經(jīng)這兩個(gè)酶酶切的pChlamy_RNAi骨架載體連接，獲得含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_ RNAi_BBS1.1/2.1_F RNAi 載體。由于靶基因片段較小，因此用KpnⅠ和NdeⅠ進(jìn)行酶切，多了中間的內(nèi)含子序列，片段大小750 bp左右（圖5-A），結(jié)果與預(yù)期大小一致，表明獲得了含有BBS1基因正向目的片段pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F 中間載體。

用NdeⅠ和XbaⅠ酶切含有BBS1基因反向目的片段的pEASY-T1-BBS1.1/2.1中間載體質(zhì)粒，與同樣經(jīng)這兩個(gè)酶酶切的含有BBS1基因正向目的片段的pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_F 中間載體連接，獲得含有BBS1基因正向和反向目的片段的pChlamy_ RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi載 體， 經(jīng)Kpn I和Xba I酶切鑒定，結(jié)果（圖5-B）表明大小與預(yù)期大小一致。

2.4 萊茵衣藻的轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因藻株的檢測(cè)與分析

采用基因槍法將pChlamy_RNAi_BBS1.1/2.1_FR RNAi 載體轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC503。轉(zhuǎn)化后先在含有潮霉素的液體培養(yǎng)基上進(jìn)行初步篩選，再涂在固體平板上進(jìn)行篩選。然后隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)干涉片段BBS1.1或BBS2.1 RNAi質(zhì)粒的轉(zhuǎn)基因衣藻單克?。總€(gè)干涉片段選取10個(gè)單克?。┻M(jìn)行提取DNA，以擴(kuò)增pChlamy_3載體上啟動(dòng)子序列的引物對(duì)HSPF1和HSPR1進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果（圖6）顯示，擴(kuò)增條帶大小約500 bp，與預(yù)期大小一致，其中只有一個(gè)單克隆未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率高達(dá)95%，證明了轉(zhuǎn)化和篩選方法的可行性。

2.5 Real-time PCR分析BBS1基因的沉默效果

取野生型CC503及轉(zhuǎn)pChlamy_RNAi_BBS1.1/ 2.1_FR質(zhì)粒的萊茵衣藻，分別提取總RNA。其中轉(zhuǎn)pChlamy_RNAi_BBS1.1_FR質(zhì)粒獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后代命名為BBS1.1_n（n代表哪個(gè)單克隆），轉(zhuǎn)pChlamy_RNAi_BBS2.1_FR質(zhì)粒獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后代命名為BBS2.1_n（n代表哪個(gè)單克?。?。以其反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈為Real-time PCR模板，進(jìn)行BBS1基因沉默效果分析。其中熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析。結(jié)果（圖7）表明，針對(duì)BBS1基因設(shè)計(jì)的RNAi干擾片段，確實(shí)抑制了BBS1的表達(dá)。

圖6 轉(zhuǎn)基因衣藻的PCR檢測(cè)

圖7 BBS1基因的mRNA表達(dá)水平

2.6 萊茵衣藻趨光性分析

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的野生型CC503及轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，放入一定體積的培養(yǎng)皿中，然后用錫箔紙包嚴(yán)，只留一定大小的空隙以便光源射入，2 h后，觀察兩株系萊茵衣藻的趨光性變化。結(jié)果（圖8）顯示，本研究所設(shè)計(jì)的針對(duì)BBS1基因上兩段干擾片段的干擾效果均較好，野生型萊茵衣藻CC503絕大部分移動(dòng)到靠近光源的一側(cè)，而干擾BBS1基因后的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻對(duì)光線不敏感。

圖8 萊茵衣藻的趨光性分析

3 討論

目前萊茵衣藻中已經(jīng)有相應(yīng)的RNAi載體，但其構(gòu)建步驟較為繁瑣，需要多次酶切和連接才能構(gòu)建成功［12，13］，而且其轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性克隆子的篩選效果也不理想。本研究搭建的RNAi載體只需在靶基因片段兩段加上合適的酶切位點(diǎn)，克隆得到的cDNA片段再經(jīng)兩次酶切與連接即可得到目的基因的RNAi載體，試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單易行，大大節(jié)約了構(gòu)建時(shí)間與實(shí)驗(yàn)成本。

隨后，針對(duì)BBS1基因設(shè)計(jì)的兩個(gè)干涉片段被構(gòu)建到我們所搭建的RNAi載體上，并轉(zhuǎn)化萊茵衣藻CC503。 轉(zhuǎn)化后的藻株先在固體平板上長(zhǎng)2 d后，轉(zhuǎn)移到含有潮霉素的液體篩選培養(yǎng)基上再培養(yǎng)一周，綠色褪去后又涂在固體平板上進(jìn)行篩選，長(zhǎng)出的單克隆95%都是陽(yáng)性，比未經(jīng)液體培養(yǎng)基篩選，轉(zhuǎn)化后直接涂在固體篩選培養(yǎng)基上獲得的單克隆陽(yáng)性率（4%）提高了幾十倍。因此該篩選方案，不僅減少了工作量，還節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本，值得同行借鑒。

對(duì)轉(zhuǎn)化BBS1基因后的藻株進(jìn)行抑制效果分析結(jié)果表明，選取的兩個(gè)干涉片段對(duì)BBS1基因均起到了明顯的抑制作用，改變了萊茵衣藻的趨光性，說(shuō)明BBS1基因在調(diào)控衣藻趨光性信號(hào)通路中起著重要作用。但其如何調(diào)控衣藻趨光性信號(hào)通路，具體由哪些基因參與，尚不清楚，是我們進(jìn)一步要研究的重點(diǎn)。我們將應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室的高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)轉(zhuǎn)BBS1基因的藻株與對(duì)照進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析，以找到其調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)及網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，為萊茵衣藻趨光性分子機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。

另外，研究發(fā)現(xiàn)有些BBS患者具有不同程度的嗅覺(jué)喪失，在BBS1或BBS4基因敲除掉的老鼠中嗅覺(jué)纖毛數(shù)目降低［14］。BBS蛋白位于纖毛或基體，它們參與了纖毛的組裝過(guò)程和信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。在線蟲(chóng)中，BBS蛋白是連接和協(xié)調(diào)“鞭毛內(nèi)運(yùn)輸”蛋白顆粒中的蛋白質(zhì)A和B復(fù)合體，是纖毛形成所必需的［15］。在斑馬魚(yú)中，BBS1基因突變后，沒(méi)有影響纖毛的形成，而是影響其運(yùn)動(dòng)性。在衣藻中，抑制BBS5的表達(dá)，纖毛將不能形成。突變BBS1、BBS4或者BBS7 基因，破壞了衣藻的趨光性［4］，但并不影響鞭毛的組裝，其趨光性的分子機(jī)制及是否影響鞭毛的運(yùn)動(dòng)尚未闡明，有待于進(jìn)一步研究。

除此之外，本研究所構(gòu)建的RNAi骨架載體直接可應(yīng)用到衣藻中其它基因功能的研究，為后期進(jìn)行BBS1基因所參與的信號(hào)通路中其它的功能基因的鑒定及同行進(jìn)行衣藻功能基因的研究提供了寶貴的載體資源。因此，本研究具有較好的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了衣藻的RNAi骨架載體，并將衣藻中BBS1基因的干涉片段構(gòu)建到該骨架載體上，轉(zhuǎn)化衣藻CC503；抑制了BBS1基因表達(dá)，改變了衣藻的趨光性。

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［15］ Ou G， Blacque OE， Snow JJ， et al. Functional coordination of intraflagellar transport motors［J］. Nature， 2005， 436（7050）：583-587.

［16］ Kim YH， Epting D， Slanchev K， et al. A complex of BBS1 and NPHP7 is required for cilia motility in zebrafish［J］. PLoS One，2013， 8（9）：e725.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Construction and Application of the RNAi Vector for BBS1 Gene in Chlamydomonas reinhardtii

Chen Lihong Li Lili Gao Lifen Zhou Junfei Li Tiantian Peng Hai
（Institute for System Biology，Jianghan University，Wuhan 430056）

Bardet-Biedl syndrome is a disease caused by mutations of various genes and associated with afunction of primary cilia. There are 12 disease-causing genes of BBS1-12 respectively. This study aimed to understand the function of BBS1 gene in Chlamydomonas reinhardtii through RNAi interference technology. Firstly， the fast and simple RNAi backbone vector was constructed. Subsequently， a cDNA in BBS1 gene was cloned into media vector pEASY-T1 using RT-PCR. After sequencing， the target fragment was inserted into the RNAi backbone vector through the twice enzyme digestion. Verified by PCR testing， enzyme digestion and sequencing， the RNAi vector of BBS1 gene was successfully constructed. The phenotype of transgenic C. reinhardtii CC503 transformed into BBS1 RNAi plasmid by gene gun was significantly different from that of the control and their phototaxis changed compared to the control.

Chlamydomonas reinhardtii；RNAi vector；BBS1 gene；phototaxis

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.016

2014-11-12

武漢市人力資源和社會(huì)保障局“衣澡冷適應(yīng)的系統(tǒng)生物學(xué)研究”項(xiàng)目

陳利紅，女，博士，助理研究員，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：clh101@126.com

彭海，男，博士，副教授，研究方向：分子遺傳學(xué)；E-mail：penghai138@163.com