魏斌，李鵬，崔勝云

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉133002）

H PLC法測定蓮子中還原型谷胱甘肽（G SH）和總巰基（-SH）含量

魏斌，李鵬，崔勝云*

（延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉133002）

利用5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）為衍生化試劑，采用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的同步衍生化提取、HPLC法測定了蓮子中GSH和總巰基（-SH）含量。本文對樣品前處理過程和色譜流動相的選擇分別進(jìn)行了優(yōu)化，有效的阻止了前處理過程中巰基氧化變性對測定靈敏度降低而導(dǎo)致的漏檢及消除了衍生化產(chǎn)物3，5-硝基-3-巰基-苯甲酸（NTB）色譜峰拖尾所造成的干擾，并借此選擇性測定了蓮子中GSH和總巰基（-SH）含量。結(jié)果表明；三次測定蓮子中GSH和總巰基（-SH）含量均值分別為0.971 1 μmol/g和1.368 6 μmol/g，方法的回收率分別為101.02%和100.09%，檢測限分別為4.21 μmol/L和4.63 μmol/L。

蓮子；高效液相色譜法；谷胱甘肽；巰基化合物；5，5，-二硫雙-2-硝基苯甲酸

蓮子（Lotus Seed）是睡蓮科蓮屬（Nelumbo nucifere Gaertn）植物種子經(jīng)剝殼取芯后的果實(shí)，是一種藥食兼用的保健食品。蓮子具有抗衰老、抗氧化、維持人體血糖穩(wěn)定、調(diào)節(jié)免疫功能等重要的生物學(xué)功能，在功能食品、藥品等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值[1-2]。蓮子除了含有較多的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素及人體必須的多種氨基酸及鈣、磷、鐵、鋅等微量元素外還含類黃酮、水溶性多糖、超氧化物歧化酶（SOD）等微量活性成分[3-5]。盡管與蓮子活性成分及生理活性相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但像GSH等含半胱氨酸殘基的含巰基活性成分測定鮮見報(bào)道。

生物體內(nèi)含半胱氨酸殘基的巰基肽及蛋白質(zhì)扮演提高機(jī)體免疫、抗氧化、重金屬解毒和代謝、促氨基酸吸收、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生物活性功能，是生物正常代謝所必需的重要活性成分，其含量的多寡與機(jī)體的健康具有重要的相關(guān)性[6-10]。生物樣品中GSH等含半胱氨酸殘基的巰基化合物的測定方法迄今報(bào)道較多的是利用衍生化試劑的光譜法和色譜法等[11-14]。其中利用衍生化試劑的光譜法因其方法簡單、操作簡便被廣泛采用。但該方法測定選擇性低，干擾較大、無法準(zhǔn)確提供不同巰基化合物相對含量信息。柱前衍生化HPLC法測定生物樣品中的巰基化合物是選擇性較高的分析方法。衍生化試劑5，5'-二硫雙-2-硝基苯甲酸（Ellman試劑，DTNB）是光譜法和色譜法測定GSH等巰基化合物的常用的衍生化試劑。該衍生化試劑與半胱氨酸殘基巰基發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)，生成巰基化合物-衍生化產(chǎn)物的復(fù)合物，同時(shí)定量釋放出衍生化反應(yīng)產(chǎn)物，3，5-硝基-3-巰基-苯甲酸（NTB）。通過測定小分子巰基化合物-衍生化產(chǎn)物復(fù)合物及定量釋放的NTB可選擇性測定小分子巰基化合物及包括巰基蛋白在內(nèi)的總巰基含量。

目前，利用DTNB衍生化試劑HPLC法測定生物樣品中巰基化合物面臨若干難題和需要改進(jìn)的地方。主要包括：1.由于測定并非是生物細(xì)胞實(shí)時(shí)分析，分析樣品制備過程包括細(xì)胞破壁、提取、去蛋白等前處理。由于巰基的還原性，前處理過程中的胞外氧化性氛圍易導(dǎo)致巰基的氧化變性，從而引起衍生化效率的降低甚至漏檢。2.衍生化反應(yīng)產(chǎn)物NTB在洗脫過程中易導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化會使色譜峰嚴(yán)重拖尾給準(zhǔn)確定量帶來困難。

為了解決上述問題，本研究采用含過量DTNB衍生化試劑的提取液，用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的同步提取達(dá)到細(xì)胞破壁的同時(shí)瞬間同步衍生化來阻止巰基的氧化變性。同時(shí)通過對色譜流動相酸度和洗脫能力進(jìn)行了優(yōu)化，并采用梯度洗脫的方法克服了NTB的拖尾。通過上述改進(jìn)，用DTNB柱前衍生化HPLC法測定了蓮子中的GSH和總巰基（-SH）含量。本研究對蓮子中活性成分的篩選、生物學(xué)功能的研究及選擇性分析生物樣品中巰基化合物方法學(xué)研究提供重要的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采用去蓮子芯后的白蓮子干品（福建產(chǎn)）作為樣品。主要試劑有5，5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸（DTNB）（國藥試劑）；還原型谷胱甘肽（國藥試劑）；半胱氨酸（Aldrich 99%）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher）；四氫呋喃（色譜純，F(xiàn)isher）；甲酸（色譜純，國藥試劑，98%），其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為三次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器：美國安捷倫公司；色譜柱為Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm）：日本GL Science公司；SCIENT-IID超聲波細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器：江蘇昆山超聲儀器有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室酸度計(jì)：上海精密儀器有限公司；Mini-10K微型離心機(jī)：珠海黑白醫(yī)學(xué)儀器有限公司；SZ-97全自動三重純水蒸餾器：上海亞榮公司。

1.3 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品和衍生化試劑儲備液：稱取還原型谷胱甘肽（GSH）0.030 7 g，移入10 mL比色管中，加入三次蒸餾水稀釋定容。制備最終濃度分別5.0×10-3mol/L的溶液。準(zhǔn)確稱取衍生化試劑DTNB 0.079 2 g，向其中加入磷酸鹽緩沖溶液（PBs，0.2mol/L，pH=7）20 mL，制備DTNB最終濃度為1.0×10-2mol/L的緩沖溶液。

1.4 樣品處理

取蓮子樣品干品，去芯、洗凈瀝干，用粉碎機(jī)粉研并磨成白色粉末。稱取粉末樣品4.0 g，加入20 mL含過量DTNB（1.0×10-2mol/L）的PBS緩沖液20 mL，利用超聲細(xì)胞破壁儀超聲破壁5 min、超聲波清洗儀超聲30 min，離心、量取10 mL上清液，加入2倍體積的乙醇，靜置30 min，抽濾，然后8 000 r/min離心10 min除蛋白、取上清液作為供試品[15]。

1.5 色譜條件

分離色譜柱用C18反相色譜柱：日本GL science公司產(chǎn)Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×150 mm）。流動相選用二元流動相體系，分別由含1%甲酸的水相A；和含10%四氫呋喃的乙腈有機(jī)相B。采用梯度洗脫，其程序?yàn)椋?0%B（0 min）14%B（12 min）28%B（22 min）80%B（35 min）10%B（40 min）。流動相流速選為0.8 mL/min，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為10 μL。由于衍生化產(chǎn)物及DTNB在所選流動相中均在λmax=327 nm處均有較強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，因此紫外檢測器的檢測波長設(shè)置為327 nm。

1.6 分析方法

由于DTNB衍生化試劑在PBS緩沖液（pH=7）中，與含半胱氨酸殘基的小分子巰基化合物（RSH）和含巰基蛋白質(zhì)（Prot-SH）發(fā)生定量衍生化反應(yīng)并釋放出1-硫-5-硝基苯甲酸（TNB）和巰基化合物與TNB的復(fù)合物（RS-TNB，Prot-S-TNB），見圖1。

如圖1所示，過量DTNB與樣品中含巰基蛋白質(zhì)（Prot-SH）和小分析巰基化合物（RSH）發(fā)生二硫鍵的交換反應(yīng)并分別生成衍生化產(chǎn)物Prot-S-TNB和RSTNB并定量釋放出TNB。由于蛋白質(zhì)衍生化產(chǎn)物（Prot-S-TNB）可通過除蛋白分離掉，分析溶液中的RS-TNB和TNB分別提供小分子巰基化合物和總巰基（-SH）含量信息。借此，利用HPLC法分別測定GSH等小分子巰基化合物和總巰基（-SH）含量。

圖1 巰基化合物與衍生化試劑DTNB的反應(yīng)衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatizing reactions between thiol compounds and DTNB

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

正如圖2所示，巰基化合物衍生化反應(yīng)定量釋放的TNB提供總巰基含量信息。但利用紫外檢測器的色譜儀同時(shí)測定R-TNB和TNB，因其兩者的光譜特性的不同，在選定的檢測波長（327 nm）條件下，TNB色譜峰嚴(yán)重拖尾導(dǎo)致無法定量測定總巰基含量。拖尾的原因可能為洗脫過程中TNB與其還原態(tài)3，5-硝基-3-巰基-苯甲酸（NTB）相互轉(zhuǎn)換所致，TNB及NTB的結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 TNB與其還原態(tài)NTB的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of TNB and its reduced form NTB

如圖2所示，TNB在λmax=412 nm的可見光區(qū)有較強(qiáng)的吸收，是目前利用光度法測定GSH等巰基化合物的主要衍生化產(chǎn)物形態(tài)。而在酸性條件下，其還原態(tài)NTB在所設(shè)色譜檢測波長（λ=327 nm）處具有強(qiáng)吸收。因此，利用所選檢測波長下同時(shí)得到所有衍生化產(chǎn)物的靈敏、無拖尾的色譜峰，須把TNB轉(zhuǎn)換成光譜特性與其他衍生化產(chǎn)物相匹配的還原態(tài)NTB。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)；通過水相中加入甲酸來提高流動相酸度使TNB充分轉(zhuǎn)換成NTB的形態(tài)，大大改善了拖尾現(xiàn)象，但其保留值隨甲酸濃度的增大而增大且峰型不對稱。這可能是由于NTB的疏水性比起TNB疏水性大導(dǎo)致不易洗脫有關(guān)。若在有機(jī)相中同時(shí)加入四氫呋喃來調(diào)節(jié)洗脫能力可有效消除了拖尾和譜峰不對稱保留值的位移。優(yōu)化的流動相組成為；有機(jī)相加入10%四氫呋喃，水相中加入1%甲酸，梯度洗脫可得到滿意的色譜峰。

2.2 蓮子中GSH和總巰基（-SH）測定

2.2.1 蓮子提取液及GSH標(biāo)準(zhǔn)品衍生化產(chǎn)物的對照測定

分別用過量DTNB（1.0×10-2mol/L）同步衍生化蓮子提取液，DTNB和GSH標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行了HPLC對照測定，結(jié)果見圖3。

圖3 A為標(biāo)準(zhǔn)品GSH（1.5×10-3mol/L）+DTNB（2×10-3mol/L）混合液的色譜圖；B為蓮子提取液的色譜圖Fig.3 A for chromatograms for GSH（1.5×10-3mol/L）+DNNB（2× 10-3mol/L）mixture B for the extract of Lotus Seeds.

如圖3所示，在過量DTNB和GSH標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中，分別觀察到衍生化產(chǎn)物GS-TNB、游離的NTB及剩余衍生化試劑DTNB的色譜峰。同樣在蓮子提取液中也觀察到了對應(yīng)的衍生化產(chǎn)物和剩余衍生化試劑的色譜峰，說明量子提取液小分子巰基化合物主要為GSH。比較兩者NTB和GS-TNB色譜信號發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的兩者峰面積之比為（402.1∶364.9=1.10），而蓮子提取液對應(yīng)的面積之比為（368.9∶239.3=1.54）。由于NTB和GS-TNB的色譜峰面積均與GSH的濃度呈線性增加，因此蓮子提取液中NTB和GS-TNB譜峰面積之比大于標(biāo)準(zhǔn)混合溶液中的色譜峰面積之比意味著蓮子提取液中的NTB是除了GSH衍生化之外還有其它含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)的衍生化反應(yīng)而釋放出來的，說明蓮子中除了GSH外還含有含半胱氨酸殘基蛋白質(zhì)等其它巰基化合物。

2.2.2 前處理對色譜測定的影響

植物細(xì)胞內(nèi)GSH等含半胱氨酸殘基的巰基化合物中巰基是重要的活性官能團(tuán)且其巰基具有還原性。因此，巰基只在細(xì)胞內(nèi)特定氧化還原氛圍中相對穩(wěn)定并發(fā)揮其生物學(xué)功能。對其胞內(nèi)的巰基化合物的分析測試中，衍生化之前的溶劑提取、去蛋白等胞外環(huán)境的操作會受胞外氧化氛圍的影響使得巰基氧化變性，導(dǎo)致嚴(yán)重降低衍生化效率和測定靈敏度[6]。

為了探討破壁之后前處理操作不當(dāng)導(dǎo)致的巰基氧化變性對測定的影響，分別用如下前處理方法得到蓮子提取液并對測定結(jié)果進(jìn)行了比較。第一種前處理方法是；利用含過量衍生化試劑DTNB的緩沖液作為提取液，采用細(xì)胞破壁、衍生化為一體的提取方法，然后對提取液除蛋白得到供試品（1）。第二種前處理方法是；先用緩沖液進(jìn)行細(xì)胞破壁提取，然后依次進(jìn)行衍生化、去蛋白得到供試品（2）。第三種前處理方法是；先用緩沖液進(jìn)行細(xì)胞破壁提取，然后依次進(jìn)行去蛋白和衍生化操作得到供試品（3）。這三種前處理方法的區(qū)別主要是；前者是細(xì)胞破壁瞬間巰基通過衍生化反應(yīng)得到有效封閉，從而避免其在衍生化和去蛋白等胞外環(huán)境下的氧化變性，而后兩者操作是衍生化之前進(jìn)行細(xì)胞破壁及除蛋白。色譜測定結(jié)果表明；三種供試品的衍生化產(chǎn)物色譜信號靈敏度具有較大的差異，對應(yīng)的衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積見下表1。

表1 不同前處理的得到的蓮子供試品的色譜峰面積Table 1 Chromatographic areas by lotus seed samples obtained by different pretreatments （mAU）

如表1所示，供試品1的衍生化產(chǎn)物色譜峰信號最強(qiáng)，供試品2對應(yīng)的衍生化產(chǎn)物的色譜信號明顯降低，而供試品3觀察不到對應(yīng)的色譜信號。這一結(jié)果說明：細(xì)胞內(nèi)的巰基化合物，破壁之后的提取、去蛋白過程中巰基極易氧化變性，明顯降低衍生化效率，從而得不到靈敏的分析信號。這可能也是目前許多生物樣品中巰基化合物漏檢和錯(cuò)檢的重要原因之一。

2.2.3 校正曲線和樣品測定

由于含半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)及小分子巰基化合物中的巰基與DTNB的衍生化反應(yīng)無選擇性，同時(shí)GSH的衍生化產(chǎn)物（GS-TNB）及NTB的色譜峰面積與GSH濃度均呈良好線性關(guān)系，因此可用GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液利用校正曲線法測定樣品種的GSH和總巰基含量。校正曲線制作過程為；利用新鮮配置的含過量DTNB（1.0×10-2mol/L）衍生化試劑的PBs緩沖液分別配置一系列GSH濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，分別在已優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行了HPLC測定。結(jié)果表明；衍生化產(chǎn)物GSTNB和NTB的色譜峰面積與GSH濃度之間呈良好的線性關(guān)系。利用該線性關(guān)系制作的校正曲線、線性回歸方程及對應(yīng)的典型色譜圖見下圖。

如圖4所示，利用三次平行測定的衍生化產(chǎn)物GS-TNB和NTB的色譜峰面積與GSH濃度間呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為Y=8.317 32+ 35.522 48X和Y=28.665 33+37.262 9X，相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 98和0.999 96。利用校正法測定了蓮子中的GSH和總巰基含量，結(jié)果見下表2。

圖4 GSH（A）和總巰基（B）含量測定的校正曲線Fig.4 Calibration plots for determination of GSH（A）and total thiols（B）

表2 蓮子中GSH和總巰基（-SH）含量Table 2 Amount of GSH and total-SH in Lotus Seed μmol/g

2.3 回收率和檢測限

利用加標(biāo)回收率進(jìn)一步驗(yàn)證了測定方法的準(zhǔn)確度。分別取一定量的蓮子提取液，然后分別加入一定濃度的不同量的GSH標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)測定的GSH和總巰基（-SH）的色譜測定結(jié)果分別計(jì)算加標(biāo)回收率。檢測限是通過選擇空白樣品平行測定的方法，利用公式Y(jié)E=μ+ks（YE指可被檢測出的最小分析信號值，μ指空白的平均信號值，s為空白測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k是與置信度有關(guān)的整數(shù)，這里取k=3）計(jì)算出被檢出的最小分析信號，然后分別利用校正曲線的線性回歸方程分別計(jì)算出GSH和-SH測定的檢測限。測定結(jié)果見下表3。

表3 方法的回收率和檢測限Table 3 Recoveries and detection limits

如表3結(jié)果所示，GSH測定的回收率均值為101.02%，檢測限為4.21 μmol/L總巰基（-SH）測定的回收率均值為100.09%，檢測限為4.63 μmol/L，滿足本測定的準(zhǔn)確度和靈敏度要求。

3 結(jié)論

1）在流動相中加入不同比例的四氫呋喃和甲酸來對流動相酸度和洗脫能力進(jìn)行了優(yōu)化，消除了衍生化產(chǎn)物NTB色譜峰拖尾的干擾，確立了用高效液相色譜法同時(shí)測定蓮子中GSH和總巰基（-SH）含量的方法。

2）采用細(xì)胞破壁同步衍生化的前處理方法，有效阻止巰基在前處理過程中氧化變性，避免巰基氧化變性導(dǎo)致的靈敏度降低及漏檢，為準(zhǔn)確測定生物樣品中活性巰基化合物的測定提供了方法學(xué)依據(jù)。

3）蓮子中GSH含量為0.971 1 μmol/g，總巰基含量為1.368 6 μmol/g。由于蓮子中其它含巰基小分子巰基化合物，像半胱氨酸含量較少，總巰基含量與GSH含量差值0.397 5 μmol/L為蓮子含有蛋白質(zhì)中的巰基含量，說明蓮子是富含GSH及含巰基活性蛋白質(zhì)的物種。

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Dertermination of Reduced Glutathione（GSH）and Total Thiols in Lotus Seeds by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）

WEI Bin，LI Peng，CUI Sheng-yun*
（Key Laboratory of Natural Resources&Functional Molecules of Changbai Mountain of Ministry of Education，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China）

Reduced glutathione（GSH）and total thiols in Lotus Seed were determined by HPLC assay utilizing 5，5'-dithio-bis（2-nitrobenzoic acid）（DTNB，Ellman's reagent）as the derivatizing agent with concomitant cell rupture during the sample pretreatment.Sample pretreatment and elution solutions were optimized in order to inhibit reduced sensitivity and serious tag of chromatographic signal for derivatized product 2-nitroso-5-thiol-benzoic acid （NTB），and selectively determined GSH and total thiols（-SH）in Lotus Seed.The results showed that the average amount of GSH and total thiols in Lotus Seed were 0.971 1 μmol/g and 1.368 6 μmol/g，the average recoveries of the methods were 101.02%and 100.09%，detection limits were 4.21μmol/L and 4.63 μmol/L respectively.

Lotus seed；HPLC；GSH；thiol compounds；DTNB

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.019

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21165021）

魏斌（1989—），男（漢），碩士研究生，從事植物活性成分測定研究。

*通信作者：崔勝云（1957—），男，教授。

2014-11-06