孫金旭

（衡水學(xué)院，河北衡水053000）

靈芝中靈芝酸的測(cè)定研究

孫金旭

（衡水學(xué)院，河北衡水053000）

利用HPLC法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量的方法，此方法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量重復(fù)性試驗(yàn)最大標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%，峰面積與靈芝酸標(biāo)品線(xiàn)性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=625.71x+82.857（R=0.998 2），加標(biāo)回收率在97.04%～102.64%之間，此方法用于靈芝中靈芝酸含量準(zhǔn)確、可行；經(jīng)測(cè)定靈芝中靈芝酸為含量1.03 mg/g。

HPLC；靈芝酸；靈芝

靈芝酸是靈芝中除靈芝多糖之外的另一種重要的藥理活性物質(zhì)，靈芝酸一般分布在靈芝子實(shí)體的外周，日本以靈芝酸含量的高低來(lái)評(píng)價(jià)靈芝質(zhì)量的好壞，他們認(rèn)為含靈芝酸越高的靈芝，質(zhì)量就越高[1]。近代研究表明，靈芝酸具有保肝、抗腫瘤[2-3]、降血糖[4]、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性，抑制膽固醇合成、鎮(zhèn)痛、抑制血小板聚集、抗氧化等功能[5]。

近些年以來(lái)，測(cè)定靈芝酸類(lèi)成分的主要方法為薄層層析法、紫外分光廣度法，因靈芝酸成分種類(lèi)繁多，結(jié)構(gòu)相近，所以在資料控制和含量測(cè)定方面存在很大的困難，本研究建立了高效液相色譜法靈芝中靈芝酸含量的方法，以期快速、準(zhǔn)確的對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)濃度為100 μg/mL；乙酸、乙腈（色譜級(jí)）無(wú)水硫酸鈉：購(gòu)于濰坊中匯化工有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜：Agilent1100美國(guó)；旋蒸儀（型號(hào)：EV311）：萊伯泰科有限公司；電子天平：上海田宮稱(chēng)重制造有限公司。

1.3 樣品等處理方法

1.3.1 靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)液處理

準(zhǔn)確秤取靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，放入容積為100mL的容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，配置成濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏備用。

1.3.2 靈芝酸的提取處理

適量秤取靈芝子實(shí)體，95%乙醇進(jìn)行超聲提取，靈芝子實(shí)體添加量0.05 g/L，提取溫度，70℃，浸提時(shí)間12 h，浸提后過(guò)濾，取濾液，真空薄膜旋蒸處理，真空濃縮至干，得到提取物浸膏，該浸膏用氯仿溶解，反復(fù)用水萃取5次，取氯仿層，過(guò)濾，取濾液，用飽和NaHCO3溶液萃取3次，取NaHCO3萃取層，3次用鹽酸調(diào)節(jié)至溶液pH為2～3之間，取沉淀物，沉淀物用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸處理，濃縮至干，得到粗靈芝酸。

1.4 HPLC測(cè)定條件[6]

HPLC法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量條件為：色譜柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6×250 mm）；流動(dòng)相：2%乙酸：2%乙腈（體積比為7∶3）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL外標(biāo)法定量；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)待定。

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的確定

為確定測(cè)定靈芝中靈芝酸高效液相色譜測(cè)定波長(zhǎng)，以靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品為測(cè)定樣品，紫外分光光度法進(jìn)行其在200 nm～500 nm下的全波長(zhǎng)掃描，掃描結(jié)果如圖1所示。

圖1 靈芝酸紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果Fig.1 The full wavelengh scanner result for Ganoderma lucidum acid

如圖1所示，靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品在200 nm～500 nm下紫外掃描后，在254 nm處有唯一最大吸收峰，表明靈芝酸紫外測(cè)定的最適波長(zhǎng)為254 nm。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

HPLC法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量條件為：色譜柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：2%乙酸：2%乙腈（體積比為7∶3）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL外標(biāo)法定量；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，此測(cè)定條件下，靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖如圖2所示。

圖2 靈芝酸標(biāo)品HPLC色譜圖Fig.2 The HPLC spectra for Ganoderma lucidum acid

由圖2可知，靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品在設(shè)定的測(cè)定條件下，在14.325 min處有單一峰，表明該測(cè)定條件適宜于靈芝酸的測(cè)定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備及線(xiàn)性范圍考察

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品放入25 mL的容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，分別配置成濃度分別為0.2、0.4、0.6、2.0、4.0、8.0、10.0 ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，此7份標(biāo)準(zhǔn)液在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，以靈芝酸濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得到線(xiàn)性回歸方程Y=625.71x+82.857（R=0.998 2），該回歸方程在1 μg～100 μg的范圍內(nèi)，線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及方程Fig.3 The standard curves and equation

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一份經(jīng)處理后靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品，均勻的分為5份，經(jīng)HPLC測(cè)定其中靈芝酸含量，計(jì)算平均值及RSD值，結(jié)果如表1所示。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)Table 1 Result of repetitive test

同一份靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品分5次進(jìn)樣后，其RSD值為1.36%，表明該方法的重復(fù)性均達(dá)到分析的要求。

2.5 回收率試驗(yàn)

取經(jīng)處理的靈芝后，平均分成3份，經(jīng)處理后，分別測(cè)定靈芝酸含量，分別取靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品配置成不同濃度，添加入處理液中，經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾后分別測(cè)定靈芝酸含量，計(jì)算回收率，結(jié)果如表2所示。

由表2可知，經(jīng)加標(biāo)后，靈芝酸的回收率在97.04%～102.64%之間，表明回收良好此方法適宜于靈芝中靈芝酸含量的測(cè)定。

表2 回收率試驗(yàn)Table 2 Recovery rates

2.6 靈芝中靈芝酸含量測(cè)定

靈芝經(jīng)處理后，得到靈芝酸粗提物，靈芝酸粗提物經(jīng)幾次萃取后，HPLC法測(cè)定其中靈芝酸含量，HPLC色譜圖如圖4所示。

圖4 靈芝酸測(cè)定高效液相圖譜Table 4 The HPLC spectra for the Ganoderma lucidum acid

有圖4可知，在設(shè)定的高效液相色譜條件下，物質(zhì)之間分開(kāi)效果較好，各物質(zhì)均能獨(dú)立成峰，且由出峰時(shí)間判斷含有欲測(cè)定的靈芝酸，表明該高效液相色譜條件較適宜于靈芝中靈芝酸含量的測(cè)定。

精確秤取靈芝10.00 g，經(jīng)處理后，進(jìn)樣測(cè)定靈芝酸含量，結(jié)果利用該方法測(cè)定出靈芝酸含量為1.03 mg/g。

3 結(jié)論

利用HPLC法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量，測(cè)定條件設(shè)定為：色譜柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相：2%乙酸：2%乙腈（體積比為7∶3）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL外標(biāo)法定量；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。研究表明：此方法測(cè)定靈芝中靈芝酸含量重復(fù)性試驗(yàn)最大標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.36%，峰面積與靈芝酸標(biāo)品線(xiàn)性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=625.71x+ 82.857（R=0.998 2），加標(biāo)回收率在97.04%～102.64%之間，此方法用于靈芝中靈芝酸含量準(zhǔn)確、可行；經(jīng)測(cè)定靈芝中靈芝酸為含量1.03 mg/g。

[1]陳靜,夏永輝,梁玲.靈芝有效成分生物活性作用的研究進(jìn)展[J].云南中醫(yī)中藥雜志,2009,30(1):61-63

[2]鄭琳,黃蔭成.靈芝菌絲體活性三萜抗腫瘤活性的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2006(8):92-93

[3]Li C H,Chen P Y,Chang M,et,al Ganoderic acid X,a lanostanoid triterpene,inhibits topoisomerases andinduces apoptosis of cancer cells[J].Life Sci,2005,77:252-256

[4]金德寬.靈芝酸對(duì)人體糖代謝調(diào)節(jié)作用的研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2012,33(11):202-205

[5]唐文.靈芝三萜類(lèi)成分抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶?活性的研究[J].上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,11(2):90-93

[6]袁媛.高純靈芝酸的分離純化工藝研究[D].合肥工業(yè)大學(xué),2007: 32-45

Determination of Ganoderma Lucidum Acid by HPLC

SUN Jin-xu
（Hengshui College，Hengshui 053000，Hebei，China）

The HPLC determination method for the determination of Ganoderma lucidum acid was established. The result showed that the maximum standard deviation of cholesterol content was 1.36%under this method for determination and Cholesterol content displayed an excellent linear relationship，the standard curve equation was Y=625.71x+82.857（R=0.998 2）.The spike recoveries for cholesterol were between 97.04%and 102.64%，the method was feasibility and accurate for using to determine Ganoderma lucidum acid，the average contents of Ganoderma lucidum acid was 1.03 mg/g by HPLC determination.

HPLC；Ganoderma lucidum acid；Ganoderma lucidum

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.08.004

孫金旭（1975—），男（漢），副教授，博士，主要從事發(fā)酵工程、食品等方面的研究。

2014-04-02