葉蕾 汪芳裕

·綜述·

間充質(zhì)干細(xì)胞在炎癥性腸病的研究與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

葉蕾 汪芳裕

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是一種具有多分化潛能的細(xì)胞，具有歸巢、組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)功能。炎癥性腸病（IBD）病因尚未完全明確，其發(fā)病與遺傳、免疫、腸道微生物和感染等因素有關(guān)。近年來MSC在IBD 中的治療作用得到越來越多的關(guān)注，是一種有前途的新型的IBD治療方法。本研究對(duì)IBD的病因及MSC在IBD的研究狀況做個(gè)綜述。

間質(zhì)干細(xì)胞； 結(jié)腸炎； Crohn??； 干細(xì)胞

炎癥性腸?。╥nfl ammatory bowel disease， IBD）是一種慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要分為潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis， UC）和克羅恩病（Crohn's disease， CD），其具體病因還未完全明確。該病呈慢性復(fù)發(fā)遷延病程，多數(shù)患者的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響。目前IBD的治療還是集中在控制炎癥活動(dòng)和調(diào)節(jié)患者免疫紊亂兩個(gè)方面［1］。近年來，利用干細(xì)胞移植來修復(fù)受損組織并調(diào)節(jié)患者的免疫功能紊亂已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)，大量的文獻(xiàn)報(bào)道證明其具有廣闊的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell， MSC）在IBD的治療作用在國內(nèi)外均得到一定程度的認(rèn)可［2］。本文主要對(duì)MSC在IBD中的研究現(xiàn)狀作一綜述，同時(shí)總結(jié)目前研究所面臨的挑戰(zhàn)。

一、MSC

1. MSC的定義：MSC首次由Friedenstein等［3］在上世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)，最初被命名為骨髓形成細(xì)胞。不同于骨髓造血干細(xì)胞，MSC來源廣泛，除了骨髓，在羊膜、脂肪組織、胎盤、牙髓，甚至經(jīng)血［4］。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在適宜培養(yǎng)條件下，MSC可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞［5］。近年來文獻(xiàn)報(bào)道MSC可以轉(zhuǎn)分化為非中胚層細(xì)胞像肝細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞［6-7］。國際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）于2006年制定了多功能MSC的基本定義［8］：（1）貼壁性；（2）表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞抗原（CD105，CD73，CD90），不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原（CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79a，CD19和HLA-DR）；（3）體外培養(yǎng)可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。但滿足這些標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞群仍具有異質(zhì)性。伴隨著大量的新的研究結(jié)果，ISCT進(jìn)一步從免疫學(xué)特征角度來細(xì)化MSC的定義，以指導(dǎo)其在臨床試驗(yàn)中的規(guī)范使用，主要有［9］：（1）MSC可以調(diào)節(jié)IFN-γ和TNF-a；（2）針對(duì)臨床患者對(duì)MSC治療的效果差異性，可以從體外培養(yǎng)細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能方面探索；（3）進(jìn)行功能分析試驗(yàn)時(shí)采用純化的免疫應(yīng)答者；（4）體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，吲哚胺2，3過氧化物酶應(yīng)答試驗(yàn)陽性；（5）動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕Y(jié)論對(duì)臨床試驗(yàn)指導(dǎo)應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度；（6）對(duì)接受MSC注射治療的患者應(yīng)鼓勵(lì)進(jìn)行淋巴細(xì)胞群落分析；（7）臨床試驗(yàn)需納入對(duì)已接受MSC注射治療的患者進(jìn)行免疫應(yīng)答的監(jiān)測(cè)。

2. MSC的免疫調(diào)節(jié)功能：MSC因其免疫調(diào)節(jié)功能被廣泛地運(yùn)用到免疫紊亂相關(guān)的疾病中，包括多發(fā)性硬化，移植物抗宿主反應(yīng)以及代謝綜合征。然而，目前為止，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制依舊沒有完全被闡明。文獻(xiàn)報(bào)道，MSC發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用主要是通過分泌具有免疫抑制功能的可溶性細(xì)胞因子［10］。已有文獻(xiàn)研究證實(shí)，MSC分泌吲哚胺2，3-雙加氧酶，進(jìn)而抑制T細(xì)胞的增殖［11］。Melief等［12］報(bào)道MSC調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的可能機(jī)制是促進(jìn)調(diào)節(jié)T細(xì)胞（Treg）的分化。MSC分泌TGF-β1直接誘導(dǎo)Treg細(xì)胞形成，或是參與單核細(xì)胞向CCL18（+）Ⅱ型巨噬細(xì)胞分化，從而間接誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化。前列腺素E2（PGE2）也是一種MSC分泌的具有生物活性的細(xì)胞因子，其可以抑制T細(xì)胞增殖和IL-2的產(chǎn)生，另文獻(xiàn)報(bào)道PGE2抑制NK細(xì)胞，DC細(xì)胞增殖，發(fā)揮免疫抑制作用［13-14］。

二、IBD的病因

IBD是慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包含兩種臨床疾病形式——UC和CD。潰瘍性結(jié)腸炎主要局限于直腸和結(jié)腸黏膜，病變呈連續(xù)性，表現(xiàn)為腸道粘膜的充血水腫及糜爛或淺潰瘍形成；而CD可以發(fā)生在胃腸道的任何一個(gè)部位，表現(xiàn)為節(jié)段性或跳躍性，病理為非連續(xù)性肉芽腫性病變。IBD確切病因仍未明，主流觀點(diǎn)將其歸因于三大因素：遺傳因素，宿主異常免疫調(diào)節(jié)和環(huán)境因素。大量的研究表明患者的一級(jí)親屬患病幾率高于流行病學(xué)的4 ～ 20倍［15］。過去20年里，運(yùn)用全基因組掃描技術(shù)，大量的候選基因被陸續(xù)報(bào)道。有研究指出，位于16號(hào)染色體上的NOD2/ CARD15基因是歐洲和北美CD患者重要的易感基因［16］。最近，發(fā)表在Nature上的一篇meta分析納入6個(gè)CD全基因組掃描研究，報(bào)道了30個(gè)新的易感基因，包括SMAD3，ERAP2，IL10，IL2RA，TYK2，F(xiàn)UT2，DNMT3A，DENND1B，BACH2和 TAGAP［17］。環(huán)境因素如腸道微生物，在IBD的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色。在無菌動(dòng)物模型中結(jié)腸炎不能被成功誘導(dǎo)間接說明了腸道菌群對(duì)于疾病發(fā)生的不可缺少性［18］。IBD是易感個(gè)體對(duì)腸道菌群紊亂的異常免疫反應(yīng)綜合所致［19］。動(dòng)物模型已經(jīng)明確指出IBD存在免疫調(diào)節(jié)失衡，主要表現(xiàn)為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)T細(xì)胞的表達(dá)失衡［20］。輔助T細(xì)胞和炎癥介質(zhì)表達(dá)失衡是腸道長(zhǎng)期炎癥狀態(tài)的重要原因［21］。

三、MSC與IBD

相比較于20世紀(jì)六十年代，IBD的治療已經(jīng)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，從以降低死亡率為目標(biāo)到以預(yù)防疾病發(fā)生為首要目標(biāo)。建立在對(duì)病情的全面評(píng)估的基礎(chǔ)上，IBD的治療采用逐步升級(jí)藥物的方案，從抗炎（氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素）到免疫抑制劑（硫唑嘌呤）或生物制劑（英夫利昔單抗）。然而，對(duì)于重度、復(fù)發(fā)性IBD的治療，目前的治療方案均沒有達(dá)到理想的黏膜愈合。干細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞、MSC和最近提出的羊膜來源的干細(xì)胞，因其再生和免疫調(diào)節(jié)特性，為IBD的治療提供了一個(gè)新的希望［22］。其中，MSC因其來源廣泛，在體外易于培養(yǎng)，成為臨床和基礎(chǔ)試驗(yàn)的研究熱點(diǎn)。

如前文所述，MSC具有免疫調(diào)節(jié)功能，幫助機(jī)體調(diào)節(jié)紊亂的免疫系統(tǒng)，這可能是MSC治療IBD的機(jī)制之一。此外，研究發(fā)現(xiàn)MSC對(duì)損傷和炎癥部位有很強(qiáng)的趨向性［23］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光顯微鏡下觀察來自于人的臍帶血MSC可以歸巢定植在結(jié)腸炎癥部位，分化為腸上皮細(xì)胞，修復(fù)受損的腸上皮細(xì)胞［24］。He等［25］構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，通過尾靜脈注射氯甲基苯甲酰氨標(biāo)記的MSC。在實(shí)驗(yàn)的第15天，被標(biāo)記的MSC聚集在結(jié)腸受損部位，且主要是在黏膜下層。那么，MSC是如何參與腸上皮細(xì)胞的損傷修復(fù)呢？文獻(xiàn)報(bào)道，MSC可以分化為腸上皮下成肌纖維細(xì)胞（ISEMF），為損傷部位MSC和腸干細(xì)胞提供重要的微環(huán)境，如生長(zhǎng)因子TGF-a，趨化因子IL-8和MCP1［26-27］。另外有部分MSC定植在上皮層，可以分化為免疫細(xì)胞，如CD45+淋巴細(xì)胞。在接受骨髓移植治療患者再生的結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)，CD45+淋巴細(xì)胞明顯高于正常人樣本［28］。

應(yīng)用于臨床上的MSC來源廣泛，包括骨髓、脂肪組織、皮膚、牙髓、臍帶血和羊水。其中，來自于患者本人或是志愿者捐贈(zèng)的骨髓來源的MSC是目前應(yīng)用最多的一類MSC。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)體外擴(kuò)增MSC，培養(yǎng)至1代至3代，未感染病原菌，流氏鑒定細(xì)胞生存能力大于90%［29］。就IBD而言，可以采用腹腔注射、靜脈注射或者是局部病變黏膜注射治療，在結(jié)腸炎的動(dòng)物模型上均取得了滿意的療效［30-32］。不同于造血干細(xì)胞，MSC使患者免于移植物抗宿主反應(yīng)，因此大大簡(jiǎn)化了患者的準(zhǔn)備程序?；颊咧皇切枰Ｒ?guī)進(jìn)行各項(xiàng)檢查，例如體格檢查、各項(xiàng)生化指標(biāo)檢查、X線和結(jié)腸鏡檢查，以評(píng)估患者疾病活動(dòng)指數(shù)，便于治療前后的療效觀察［29］。

1.MSC與UC：臨床上針對(duì)MSC在UC患者中的治療報(bào)道并不多。Lazebnik等［33］學(xué)者納入96例UC患者，其中44例患者接受MSC注射治療，40例患者接受以美沙拉嗪為代表的標(biāo)準(zhǔn)治療，另外12例患者進(jìn)行英夫利昔維持緩解治療。臨床結(jié)果發(fā)現(xiàn)34例進(jìn)行MSC移植治療的患者，其自身免疫反應(yīng)和損傷黏膜的修復(fù)與其他兩組患者有著顯著的差異性，提示MSC可以作為一種新的治療策略。對(duì)于葡聚糖酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，MSC通過其抗炎調(diào)節(jié)作用，顯著降低病變黏膜和血漿中的促炎因子（如TNF-a，IL-β）［34］。Wang等［34］學(xué)者進(jìn)一步提出，IL-37b基因轉(zhuǎn)染到MSC中可以協(xié)同MSC的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而增強(qiáng)MSC在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中的療效。然而，Nam等［35］研究發(fā)現(xiàn)腹腔注射MSC并不能阻止DSS誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生以及降低IBD的臨床病理嚴(yán)重程度。

表1　針對(duì)IBD患者的臨床試驗(yàn)情況（2015）

2.MSC與CD：González MA等［36］向結(jié)腸炎小鼠體內(nèi)腹腔注射105～ 106脂肪來源的MSC，發(fā)現(xiàn)其可以顯著減輕疾病的嚴(yán)重程度，腸道的炎癥并防止結(jié)腸炎的再次復(fù)發(fā)。骨髓來源的MSC也有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［37］。Duijvestein等［38］學(xué)者研究指出用IFN-γ轉(zhuǎn)染骨髓MSC，可以增強(qiáng)MSC在結(jié)腸炎小鼠的療效。這些體內(nèi)試驗(yàn)表明MSC治療可能對(duì)早期的結(jié)腸炎有效，然而，MSC對(duì)于臨床上復(fù)發(fā)且難治性的CD患者是否有效，還有待于標(biāo)準(zhǔn)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)。目前，已登記注冊(cè)的針對(duì)MSC在CD患者療效評(píng)估的臨床試驗(yàn)總共有7例［39）［39］。García-Olmo D等［40］開展臨床一期試驗(yàn)，追蹤并發(fā)瘺管的CD患者在接受脂肪來源的MSC局部注射治療12 ～ 30個(gè)月后，不良反應(yīng)的發(fā)生率。令人興奮的是，不良反應(yīng)發(fā)生率為0%，且MSC可以促進(jìn)上皮細(xì)胞的再生和75%的肛周瘺管愈合。試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)有力地支撐了MSC在難治性多發(fā)性CD患者的治療前景。同樣的觀察結(jié)果也在一項(xiàng)多中心臨床隨機(jī)試驗(yàn)中被報(bào)道［41］。然而，MSC靜脈注射治療黏膜病變的CD患者，療效卻差強(qiáng)人意。在Duijvestein等［42］的研究中，10例重度CD患者進(jìn)行骨髓MSC移植，在移植后6周，僅有3例患者病情得到緩解。Lazebnik等［43］納入11例CD患者，靜脈輸注骨髓來源的MSC，4 ～ 8個(gè)月后，患者的臨床癥狀并未得到明顯改善。

雖然臨床試驗(yàn)研究結(jié)果不一，但在體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，MSC均可以抑制T細(xì)胞增殖，表明患者對(duì)干細(xì)胞治療的反應(yīng)差異性并不是由MSC免疫調(diào)節(jié)能力缺陷所致，可能與患者個(gè)體差異性和移植途徑有關(guān)。這些研究也提示病變部位局部注射MSC的療效優(yōu)于靜脈注射。但是，臨床數(shù)據(jù)顯示MSC僅對(duì)部分難治性復(fù)發(fā)性CD患者有效，且這些研究的結(jié)果指標(biāo)并不相同（瘺管愈合vs疾病活動(dòng)度），因此，正確評(píng)估MSC治療CD患者還需要更多的臨床及臨床前期研究。目前，大量的臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)正在開展以更好地評(píng)價(jià)MSC治療方案的有效性和安全性。

四、展望

MSC在IBD中的應(yīng)用價(jià)值已經(jīng)成為當(dāng)今臨床和基礎(chǔ)的研究熱點(diǎn)，但研究結(jié)果差強(qiáng)人意。這有多方面的限制因素。例如，缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的MSC階段性治療方案，以及缺少對(duì)MSC的生物學(xué)特性的深入全面理解。從MSC的分離提取，到體外培養(yǎng)再到移植途徑，甚至對(duì)于治療目標(biāo)的選擇，都會(huì)影響到對(duì)治療效果的最終判斷。

1.MSC異質(zhì)性：MSC是一群異質(zhì)性基質(zhì)干細(xì)胞，沒有特異性分子標(biāo)記物。雖然2013年ISCT從MSC免疫學(xué)特點(diǎn)細(xì)化了相關(guān)的定義，但目前識(shí)別并確認(rèn)MSC依舊是依據(jù)2006年ISCT所制定的指南。該指南缺少M(fèi)SC的功能性表面分子標(biāo)記物，可以將MSC與成纖維細(xì)胞或者其他與MSC類似的基質(zhì)細(xì)胞區(qū)分開。這也就意味著目前研究中所提到的MSC移植，很有可能會(huì)混入其他基質(zhì)細(xì)胞，而它們對(duì)于最終結(jié)果的影響并不為人們所知。因此，在應(yīng)用MSC進(jìn)行干預(yù)之前，一個(gè)更加具體且準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)亟待被公認(rèn)。值得一提的是，不同來源的MSC在分化調(diào)控中可以誘發(fā)宿主不同的免疫反應(yīng)特點(diǎn)，而目前的臨床試驗(yàn)利用的是不同種類MSC來評(píng)估療效［44］。Orbsen治療最近從骨髓、胎盤、骨骼肌和脂肪中分離出一種具有較高同質(zhì)性的MSC，都表達(dá)CD362［45］。針對(duì)這種細(xì)胞治療前景的前期研究已經(jīng)在開展。期待它可以為干細(xì)胞治療提供一個(gè)更好的材料來源。

2.臨床試驗(yàn)方案的標(biāo)準(zhǔn)化：當(dāng)前的臨床研究采用不同劑量的MSC，有研究采用106個(gè)/kg，有研究則是5×106個(gè)/kg。國際上普遍采用1.4×106個(gè)/ kg來治療移植物抗宿主?。?6］。在一項(xiàng)同種自體的MSC研究中，CD患者每周接受2次靜脈注射治療，細(xì)胞量分別為1×106個(gè)/kg，2×106個(gè)/kg［47］。但并沒有證據(jù)表明注射更大劑量的MSC可以提高臨床療效。有報(bào)道，隨著MSC的培養(yǎng)和傳代，它們會(huì)逐步失去增殖分化和免疫調(diào)節(jié)功能［48］。正常情況下，臨床前期的研究所使用的MSC是在1 ～ 5代之內(nèi)，而在更大規(guī)模的多中心的研究中，需要足夠數(shù)量的MSC植入患者體內(nèi)，此時(shí)MSC常常在體外擴(kuò)增培養(yǎng)到5代之后。那么，值得關(guān)注的是，在長(zhǎng)期的體外培養(yǎng)中，MSC會(huì)不會(huì)逐漸減弱其免疫調(diào)節(jié)功能或者培養(yǎng)條件是否會(huì)對(duì)其產(chǎn)生不利影響。不止這樣，靜脈注射時(shí)，MSC歸巢的比例很低（＜ 1%），大部分滯留在肺臟和肝臟［49］。因此，有理由推測(cè)試驗(yàn)中觀察到的治療后癥狀改善，很有可能是由免疫細(xì)胞所產(chǎn)生的可溶性介質(zhì)所致，而非MSC在病變部位的分化調(diào)控所致。相比較之下，局部定點(diǎn)注射療效勝于傳統(tǒng)的靜脈注射［49］。陸續(xù)報(bào)道的相互沖突的試驗(yàn)結(jié)果提示制定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的MSC治療方案十分必要，只有這樣才可以使得治療效果得到最優(yōu)化。

3.MSC潛在的致病性：長(zhǎng)期的炎性微環(huán)境對(duì)內(nèi)源性MSC的表型影響依舊不是很清楚。MSC可能會(huì)通過轉(zhuǎn)分化從而失去其免疫調(diào)節(jié)能力甚至成為促炎細(xì)胞。有研究曾指出在TLR4的刺激下，MSC可以發(fā)生極化成為促炎細(xì)胞［50］?，F(xiàn)在仍然不清楚其他的炎癥介質(zhì)是不是可以誘導(dǎo)MSC的這種轉(zhuǎn)變。但是炎性微環(huán)境可以轉(zhuǎn)變其他基質(zhì)細(xì)胞的表型已有報(bào)道［51］?？傊?，這些研究表明MSC對(duì)其所處的微環(huán)境敏感，可以隨著環(huán)境的改變發(fā)生表型變化，從抗炎介質(zhì)變?yōu)榇傺准?xì)胞。因此，炎性微環(huán)境對(duì)于MSC的功能影響需要進(jìn)一步的研究。

五、結(jié)論

MSC在IBD中的治療依舊處于一個(gè)探索階段，許多臨床或者基礎(chǔ)研究的問題需要得到解決。但相信，隨著MSC移植技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的IBD患者將從中獲益，也為IBD提供新的治療方法。

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Clinical and basic studies on mesenchymal stem cell therapy for inflammatory boweldisease

Wang Fangyu， Email：wangfangyul@126.com

Mesenchymal stem cells（MSC） arecells with multipotentdifferentiation capacity and are capable of selectively homing to inflammation areas for tissue healing and immunoregulation. The etiology of inflammatory bowel diseases （IBD） is not yet fully elucidated， which is thought to be associated with gene， immunity， gut microbiome and infection，etc. In recent years， MSC have attracted more and more attention in the treatment of IBD. It seems to be a new promisng therapy in IBD. In the review， we will focus on the causes of IBD and the status of researches of MSC for IBD.

Mesenchymal stem cells； colitis； Crohn Disease； stem cell

2015-09-02）

（本文編輯：蔡曉珍）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.008

210002，南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院消化內(nèi)科

汪芳裕，Email：wangfangyul@126.com

Ye Lei， Wang Fangyu. Department of Gastroenterology and Hepatology， Jinling Hospital， Medical School of Nanjing University， 305 Zhongshan East Road， Nanjing 210002，China