呂曉霞張精勇陳幗玲高培顯王茂華吳學(xué)君金星

自體骨髓干細(xì)胞移植治療重度下肢缺血性疾病的療效分析

呂曉霞1張精勇1陳幗玲2高培顯1王茂華1吳學(xué)君1金星1

目的 觀察自體骨髓干細(xì)胞移植治療慢性下肢缺血的臨床療效。方法 觀察山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科自2004年9月至2012年9月接受自體干細(xì)胞移植的下肢重度缺血患者79例，評(píng)定患者自體骨髓干細(xì)胞移植前、移植后1個(gè)月及6個(gè)月時(shí)患肢疼痛評(píng)分、踝肱指數(shù)、間跛距離的改變情況來(lái)評(píng)價(jià)臨床療效。結(jié)果 治療后1個(gè)月及6個(gè)月，患肢疼痛評(píng)分由術(shù)前的7.51 ± 1.18緩解至術(shù)后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。移植后1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。間跛距離由術(shù)前的（65 ± 15）m，增加至術(shù)后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。移植后1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。踝肱指數(shù)由術(shù)前的0.22 ± 0.10，提高至術(shù)后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，與術(shù)前比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。移植后1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。結(jié)論 自體骨髓干細(xì)胞移植對(duì)緩解肢體疼痛，提高間跛距離，加快潰瘍面愈合療效確切。

骨髓； 干細(xì)胞移植； 自體； 下肢； 缺血； 動(dòng)脈閉塞

下肢動(dòng)脈缺血性疾病嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，威脅老年人的生命健康。隨著我國(guó)逐漸進(jìn)入老齡社會(huì)，以及人們飲食生活習(xí)慣的改變，下肢動(dòng)脈缺血性疾病的發(fā)病率越來(lái)越高。周圍動(dòng)脈閉塞性疾病患病率為每年500 ～ 1 000/百萬(wàn)［1-2］，其中4.3%～ 9.6%最終發(fā)展為嚴(yán)重肢體缺血，最后導(dǎo)致截肢［3］。藥物治療、介入治療和動(dòng)脈搭橋手術(shù)是下肢動(dòng)脈慢性缺血性疾病的主要治療方法。許多存在靜息痛的重度下肢動(dòng)脈缺血患者，已經(jīng)喪失動(dòng)脈搭橋和介入治療條件，藥物治療效果不理想，仍沒有滿意的治療方法。我院血管外科依據(jù)骨髓干細(xì)胞具有高度增殖并分化為體內(nèi)各種細(xì)胞的潛能，移植后能夠提供各種成血管細(xì)胞因子，促進(jìn)血管生成的原理，應(yīng)用自體骨髓干細(xì)胞移植技術(shù)治療79例慢性下肢缺血疾病患者，取得滿意療效，總結(jié)報(bào)道如下。

資料與方法

一、一般資料

下肢動(dòng)脈慢性缺血性病變無(wú)動(dòng)脈搭橋術(shù)或介入治療適應(yīng)證并愿意接受干細(xì)胞移植的患者79例，男51例，女28例，年齡在33 ～ 83歲之間，平均年齡67歲。其中下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥49例，血栓閉塞性脈管炎9例，糖尿病足21例。其中12例曾行介入治療，2例曾行動(dòng)脈搭橋治療。全部患者均有足部和（或）下肢發(fā)涼、麻木、間歇性跛行、靜息痛，11例患者存在足趾潰瘍，8例患者存在足趾壞疽。輔助檢查：79例患者均經(jīng)下肢血管彩色多普勒、CT血管成像和（或）動(dòng)脈造影檢查，股淺動(dòng)脈、股深動(dòng)脈存在長(zhǎng)段狹窄或者閉塞72例，腘動(dòng)脈狹窄或者閉塞66例，79例均存在脛前動(dòng)脈、脛后動(dòng)脈和腓動(dòng)脈廣泛狹窄或者閉塞。

二、方法

（一）納入標(biāo)準(zhǔn)

（1）行數(shù)字減影血管造影、CT血管造影顯示患肢膝下動(dòng)脈廣泛狹窄或閉塞；（2）無(wú)法行搭橋手術(shù)及介入治療；（3）經(jīng)藥物治療，患肢靜息痛不能明顯緩解；（4）所有患者均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、嚴(yán)重心肺腦等臟器功能不全等。

（二）病情評(píng)估

全部患者分別于移植前、移植后1個(gè)月，6個(gè)月，通過患肢疼痛評(píng)分、踝肱指數(shù)、間跛距離對(duì)患肢缺血程度進(jìn)行評(píng)價(jià)；疼痛評(píng)分：按患肢靜息痛程度分別記為0 ～ 10分，0分為無(wú)痛，10分為最劇烈疼痛。踝肱指數(shù)測(cè)定：移植前、移植后1個(gè)月、6個(gè)月測(cè)量患肢踝肱指數(shù)；間跛距離測(cè)定：移植前、移植后1個(gè)月、6個(gè)月測(cè)量患肢踝肱指數(shù)。

（三）移植方法

1.術(shù)前骨髓評(píng)估：移植前進(jìn)行骨髓像評(píng)估，術(shù)前先抽取0.1 ml做骨髓涂片以排除血液病，本組發(fā)現(xiàn)3例骨髓增殖減低，應(yīng)用粒、單核細(xì)胞集落刺激因子，4 d后復(fù)查明顯好轉(zhuǎn)。單個(gè)核細(xì)胞的獲得：患者取俯臥位，床旁心電監(jiān)護(hù)。取雙側(cè)髂后上棘為骨髓穿刺點(diǎn)，常規(guī)消毒，鋪洞巾，1%的利多卡因行穿刺部位局部麻醉。穿刺的合適深度為骨穿針被髂骨固定，抽取骨髓時(shí)，先抽取1 ml肝素鹽水再抽取9 ml的骨髓血。使用多側(cè)孔骨髓穿刺針，多點(diǎn)多方向抽取，可以抽取更多的骨髓血。抽取自體骨髓血300 ～ 400 ml，貼壁注入無(wú)菌骨髓血保養(yǎng)袋中，混勻。在體外經(jīng)過人間充質(zhì)干細(xì)胞分離液處理，離心后提取單個(gè)核細(xì)胞層，分離的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)為（0.038 ～ 8.6）× 108個(gè)。

2.干細(xì)胞鑒定：對(duì)分離的骨髓干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)志，流式細(xì)胞儀分析具有：HMSC獨(dú)特的表型特征，即CD29、CD44陽(yáng)性和CD34、CD45陰性。表達(dá)的細(xì)胞比率分別為CD29（94.3%），CD44（94.3%）和CD34（1.7%），CD45（0.9%）。

3.干細(xì)胞移植：硬膜外麻醉，根據(jù)CT血管造影，在動(dòng)脈閉塞近端約5 cm處開始注射，一直注射至足部。注射點(diǎn)用記號(hào)筆標(biāo)記。注射點(diǎn)沿主要血管走行區(qū)域縱向線型排列，一般患肢內(nèi)、外側(cè)，足背、足底各3列，上下每?jī)牲c(diǎn)之間間隔約1 cm，兩排之間間隔1.5 ～ 2 cm，注射量為0.5 ml/穿刺點(diǎn)，患者所需注射液總體積為注射針數(shù)× 0.5 ml，以生理鹽水將提取的干細(xì)胞稀釋至所需注射液量。注射深度要注射入患肢肌肉層內(nèi)，依胖瘦不同約為皮下1 ～ 2 cm，注射后以無(wú)菌紗布，彈力繃帶加壓包扎。術(shù)后1 ～ 2 d出院。

4.隨訪情況：患者出院前，術(shù)后1個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月門診隨訪，記錄患者的疼痛評(píng)分，踝肱指數(shù)，間跛距離，并觀察患肢皮膚潰瘍愈合情況。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，疼痛評(píng)分、間跛距離和踝肱指數(shù)均以±s表示，移植前后觀察指標(biāo)的對(duì)比，使用自身配對(duì)資料的t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　果

1.隨訪結(jié)果：所有患者均接受臨床隨診，無(wú)脫漏，隨訪6 ～ 18個(gè)月，平均12個(gè)月，移植過程中以及移植后均無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥發(fā)生，所有患者隨訪期間無(wú)死亡。

2.臨床效果：患者觀察指標(biāo)評(píng)分：治療后1個(gè)月及6個(gè)月，患肢疼痛評(píng)分由術(shù)前的7.51 ± 1.18緩解至術(shù)后4.03 ± 1.12，3.38 ± 1.32，與術(shù)前比較差異有顯著性意義（P ＜ 0.05）。移植后 1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)顯著性意義（P ＞ 0.05）。間跛距離由術(shù)前的（65 ± 15）m，增加至術(shù)后的（165 ± 105）m，（195 ± 95）m，與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。移植后1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。踝肱指數(shù)由術(shù)前的0.22 ± 0.10，提高至術(shù)后的0.31 ± 0.05，0.34 ± 0.09，與術(shù)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。移植后1個(gè)月與移植后6個(gè)月評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）。

術(shù)后第1天患者均反映患肢不適感好轉(zhuǎn)，靜息痛減輕。術(shù)后1個(gè)月57例（72.2%）患者靜息痛消失或明顯減輕，冷感減輕。11例伴有潰瘍的患者，移植后1個(gè)月潰瘍完全愈合3例，潰瘍創(chuàng)面明顯縮小5例，無(wú)明顯變化3例，有效率72.7%；移植1年后肢體潰瘍愈合7例，潰瘍創(chuàng)面明顯縮小2例，無(wú)明顯變化2例，有效率為81.8%。8例足趾壞疽患者中，3例癥狀明顯緩解，靜息痛消失，行壞疽足趾切除，愈合良好；4例疼痛消失，壞疽邊界清楚，等待壞疽組織自行有脫落；1例于膝下截肢。

本組病例中有11例于術(shù)后3 ～ 6個(gè)月癥狀出現(xiàn)反復(fù)。3例表現(xiàn)為晚間患肢麻木、怕冷，但無(wú)明顯疼痛；4例表現(xiàn)為跛行距離恢復(fù)至術(shù)前水平，繼續(xù)應(yīng)用藥物治療；4例再次出現(xiàn)靜息痛，其中3例再次給予自體干細(xì)胞移植，靜息痛消失；1例行膝下截肢手術(shù)，術(shù)中發(fā)現(xiàn)殘端血運(yùn)豐富，術(shù)后創(chuàng)面愈合良好。

討　論

2002年，國(guó)際上首次報(bào)道了骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療下肢動(dòng)脈缺血性疾病的臨床應(yīng)用［4］。2004年，Gu等［5］首次報(bào)道了在國(guó)內(nèi)將骨髓間充質(zhì)細(xì)胞應(yīng)用于下肢缺血性疾病中取得良好效果，隨后國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院將此項(xiàng)治療技術(shù)應(yīng)用于臨床工作并進(jìn)行報(bào)道［6-7］。

隨著干細(xì)胞研究的深入及其分離技術(shù)的發(fā)展，用干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病使很多患者受益。目前研究表明，成體干細(xì)胞具有多分化潛能，可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步分化形成新生毛細(xì)血管。自體干細(xì)胞移植正是利用這一原理，將干細(xì)胞移植到缺血的肢體肌肉中，使其分化、形成新生毛細(xì)血管，改善和恢復(fù)下肢血流，達(dá)到治療下肢缺血的目的。

骨髓干細(xì)胞移植治療下肢缺血性疾病的機(jī)制可能與以下因素有關(guān)［8］：（1）分泌促血管生成因子促進(jìn)缺血壞死區(qū)域血管網(wǎng)絡(luò)重建；（2）體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)多種骨髓源性干細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞，干細(xì)胞可能作為細(xì)胞材料參與血管壁的組成；（3）通過旁分泌途徑促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的建立，并能擴(kuò)大動(dòng)脈內(nèi)徑改善有效的血液灌注；（4）抑制組織凋亡。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了干細(xì)胞移植通過抑制下肢缺血壞死組織的細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管形成、減小潰瘍面積等機(jī)制參與改善下肢血運(yùn)功能。

另一個(gè)值得注意的現(xiàn)象是，雖然所有研究均報(bào)道取得良好效果，但是不同的研究所移植的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量卻明顯不同。在骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植的報(bào)道中，抽取的骨髓量介于80 ～ 1 000 ml，獲取的單個(gè)核細(xì)胞從0.1 × 109至34 × 109數(shù)量相差懸殊［4，9-10］。本組病歷每例患者抽取自體骨髓血300 ～ 400 ml，分離的單個(gè)核細(xì)胞計(jì)數(shù)為（0.038 ～ 8.600）× 108個(gè)，患者均取得較好的治療效果，表明干細(xì)胞移植在一定干細(xì)胞數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)均可以達(dá)到治療效果，移植的干細(xì)胞數(shù)量與肢體缺血的治療效果之間的關(guān)系還需要更加深入地進(jìn)行研究。

本組資料發(fā)現(xiàn)，自體干細(xì)胞移植能夠明顯緩解患者下肢缺血癥狀，尤其能夠緩解患者靜息痛。術(shù)后第1天患者均反映患肢不適感好轉(zhuǎn)，靜息痛減輕。術(shù)后1個(gè)月72.2%的患者靜息痛消失或明顯減輕，冷感減輕。疼痛評(píng)分術(shù)前與術(shù)后1個(gè)月，6個(gè)月比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。靜息痛是下肢缺血患者的巨大痛苦，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，影響患者睡眠、飲食，進(jìn)而誘發(fā)心腦血管疾病，威脅患者生命。干細(xì)胞移植通過緩解患者靜息痛，能夠明顯提高患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)患者的壽命。但在對(duì)比自體干細(xì)胞移植術(shù)后6個(gè)月與1個(gè)月的觀察指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，雖然疼痛評(píng)分，踝肱指數(shù)以及間跛距離均有改善，但兩者之間比較均沒有顯著性差異，說(shuō)明自體干細(xì)胞移植1個(gè)月后，患肢血運(yùn)改善處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，自體干細(xì)胞并沒有進(jìn)一步明顯改善患肢的缺血狀況。本組病例數(shù)量較少，隨訪時(shí)間不足，還應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步增加病例數(shù)量及隨訪時(shí)間，明確自體干細(xì)胞移植改善患肢血運(yùn)效果與時(shí)間的關(guān)系。

本組病例中有11例于術(shù)后3 ～ 6個(gè)月癥狀出現(xiàn)反復(fù)，其中3例出現(xiàn)靜息痛的患者再次給予自體干細(xì)胞移植，靜息痛消失。筆者認(rèn)為自體干細(xì)胞移植創(chuàng)傷小，對(duì)部分1次移植后效果不滿意或癥狀出現(xiàn)反復(fù)的患者，可以再次進(jìn)行自體干細(xì)胞移植，多能明顯改善患者癥狀。

下肢動(dòng)脈缺血患者多為老年人，本組患者平均年齡67歲，多合并心腦血管疾病，在抽取患者骨髓血時(shí)，需要對(duì)患者進(jìn)行心電監(jiān)護(hù)，同時(shí)靜脈補(bǔ)充液體，防止抽取骨髓血過程中，患者血容量短時(shí)間內(nèi)減少，造成患者不適，誘發(fā)心腦血管意外。一般抽取骨髓血300 ～ 400 ml，提取干細(xì)胞后利用生理鹽水將干細(xì)胞稀釋至所需液體量。注射干細(xì)胞時(shí)，每注射點(diǎn)注射干細(xì)胞液0.5 ml，注射深度應(yīng)為1 cm左右，在肢體消瘦的患者注射時(shí)，可以斜行注射，注射針頭稍停頓后再退出，注射后應(yīng)用紗布稍作按壓，防止干細(xì)胞液反流出體外，造成干細(xì)胞液浪費(fèi)。干細(xì)胞移植完成后，應(yīng)利用彈力繃帶適當(dāng)加壓包扎，更好的利于干細(xì)胞吸收。

基礎(chǔ)和臨床研究均表明，干細(xì)胞移植治療動(dòng)脈缺血性疾病療效是肯定的［5，11-12］，綜合本臨床觀察結(jié)果提示，自體骨髓干細(xì)胞移植能夠明顯緩解肢體疼痛，同時(shí)增加踝肱指數(shù)，提高間跛距離，且未發(fā)現(xiàn)明顯副作用。相信隨著自體骨髓干細(xì)胞移植研究的深入，將為喪失手術(shù)和介入治療機(jī)會(huì)的重癥下肢動(dòng)脈缺血性疾病治療開辟新的天地。

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Efficacy of autologous bone marrow stem cell transplantation in treatment of lower limbischemia

Lyu Xiaoxia1， Zhang Jingyong1， Chen Guoling2， Gao Peixian1， Wang Maohua1，Wu Xuejun1， Jin Xing1.1Department of Vascular Surgery， Provincial Hospital affiliated to Shandong University， Jinan 250021，China；2Medstar Georgetown University Hospital， Washington DC 20007， USA

Zhang Jingyong， Email： zhangjingyongys@163.com

Objective To evaluate the efficacy of autologous transplantation of bone marrow stem cell （BMSC） for treating chronic ischemia of the lower limbs. Methods Totally 79 patients with chronic ischemia of the lower limb were enrolled from September 2004 to September 2012. All the patients were not suitable for surgery treatment or interventional treatment and were willing to receive autologous BMSC transplantation.The clinical outcomes of patients were assessed by pain symptom， walking ability， ankle-brachial index of the lower limbs before and 1 and 6 months after BMSC treatment. Results The pain score decreased at 1 and 6 months after transplantation compared with that before transplantation， and the difference was significant （P ＜ 0.05）.There was no significant difference in pain score between 1 month after transplantation and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Ankle-brachial index was significantly increased at 1 and 6 months when compared with that before transplantation，and the difference was significant （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 month and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. The walking distances was significantly increased at 1 month and 6 months， and there was significant difference of walking distancewhen compared with that before transplantation （P ＜ 0.05）. There was no significant difference between 1 months and 6 months after transplantation （P ＞ 0.05）. Conclusion Autologous BMSC transplantation was effective in terms of pain and walking distance， and can promote wound healing in patients with chronic ischemia of the lower limbs.

Bone marrow； Stem cell transplantation； autologous； lower limb；ischemia； artery occlusion

2015-03-09）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.003

250021 濟(jì)南，山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科1；20007，美國(guó)華盛頓哥倫比亞特區(qū)喬治城大學(xué)醫(yī)院移植外科2

張精勇，Email： zhangjingyongys@163.com