王紅高美玲蘭婧喬歡李夏青

小鼠神摯母細(xì)胞瘤細(xì)胞株用于A型肉毒毒素重鏈體外實驗的可行性研究

王紅1高美玲1蘭婧1喬歡2李夏青1

目的 探討小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（Neuro-2a）細(xì)胞株用于A型肉毒毒素重鏈（BoNT/A HC）體外細(xì)胞模型的可行性。方法 對體外培養(yǎng)1 ～ 5 h的Neuro-2a細(xì)胞和經(jīng)A型肉毒毒素（BoNT/A）重鏈作用的Neuro-2a細(xì)胞（細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板后隨機(jī)分為對照組、0.01 nmol/L組、0.1 nmol/L組、1 nmol/L組和10 nmol/L組），進(jìn)行BoNT/A HC相關(guān)受體的檢測，觀察BoNT/A HC作用不同時間（24、48及72 h）后BoNT/A HC對細(xì)胞突起生長狀況的影響，包括有突起細(xì)胞的百分比、細(xì)胞突起的長度以及突起總數(shù)。數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 5.0 One-way ANOVA分析。結(jié)果 體外培養(yǎng)后Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)高親和力的突觸囊泡蛋白2 （SV2）和低親和力的三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂亞型1b （GT1b）受體。與對照組相比，BoNT/A HC能明顯促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起再生及突起長度增加，其中0.1 nmol/L BoNT/A HC作用24 h后突起的Neuro-2a細(xì)胞百分比為（20.61± 4.87）%高于對照組［（15.27± 3.56）%，F(xiàn) = 37.7，P ＜ 0.001］、神經(jīng)突起的總數(shù)量為（2.18 ± 1.24）個高于對照組（1.68 ± 0.99）個，（F = 9.54，P ＜ 0.001）、平均突起的長度為（38.76 ± 38.11） μm，與對照組（23.38 ± 27.13）μm相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；當(dāng)BoNT/A HC的濃度增加為1、10 nmol/L時，有突起的Neuro-2a細(xì)胞百分比分別為（15.08 ± 5.27）%和（12.65 ± 5.65）%，神經(jīng)突起的總數(shù)量分別為（1.65 ± 0.85）個和（1.64 ± 0.85）個、平均突起的長度分別為（33.75 ± 39.11）μm和（18.95 ± 21.71） μm，與對照組相比差別不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨作用時間的延長（48 h和72 h）0.1 nmol/L組有突起細(xì)胞的百分比、細(xì)胞突起的長度以及突起總數(shù)與對照組相比均增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而1，10 nmol/L組中細(xì)胞變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 Neuro-2a細(xì)胞可用于BoNT/A HC體外研究的細(xì)胞模型，BoNT/A HC的作用表現(xiàn)為低濃度（0.1 nmol/L）的促進(jìn)作用而高濃度（10 nmol/L）時呈現(xiàn)抑制。

肉毒毒素類； 突觸蛋白類； 神經(jīng)節(jié)苷脂類

A型肉毒毒素（botulinum neurotoxin serotype A，BoNT/A）是由BoNT/A桿菌產(chǎn)生分泌的外毒素，是所有肉毒毒素血清類型中毒性作用最強(qiáng)且研究也最為廣泛的一種［1］。研究證實BoNT/A的毒性作用主要是通過阻斷膽堿能神經(jīng)末梢釋放乙酰膽堿導(dǎo)致神經(jīng)肌肉接頭去神經(jīng)化，骨骼肌不能收縮發(fā)生麻痹而致。利用該機(jī)制，近半個世紀(jì)以來，BoNT/A廣泛用于美容除皺，治療斜視、眼瞼和面肌痙攣、痙攣性斜頸、以及其它肌肉收縮過度的臨床病癥［1-2］。越來越多的臨床觀察BoNT/A在緩解臨床慢性病理性疼痛方面亦具有明顯療效［2］。此外體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn)BoNT/A局部注射后期可伴有運(yùn)動終板樣結(jié)構(gòu)形成［3-6］，培養(yǎng)液內(nèi)加入一定濃度的BoNT/A可以刺激脊髓運(yùn)動神經(jīng)元突起生長的作用［7］。因此，BoNT/A已經(jīng)成為治療許多臨床頑癥的新藥制劑研究方向之一。

BoNT/A主要通過與宿主細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合形成毒素-膜受體復(fù)合物，介導(dǎo)毒素進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮毒性作用。受體分為蛋白受體和神經(jīng)節(jié)苷脂兩種，其中突觸囊泡蛋白2（synaptic vesicle 2，SV2）是與BoNT/A結(jié)合的高親和力受體［8-13］，三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂亞型1b（trisialoganglioside 1b， GT1b）是與BoNT/A結(jié)合的低親和力受體［14］。GT1b與BoNT/A的結(jié)合可以促進(jìn)細(xì)胞膜上高親和力受體在膜上的漂移和簇集，使得毒素快速有效地與膜蛋白結(jié)合形成毒素—受體復(fù)合物入胞［15］。

BoNT/A由重鏈（heavy chain， HC）和輕鏈（light chain， LC）兩部分組成。HC主要含有與宿主膜蛋白相結(jié)合的功能區(qū)域，HC與宿主相應(yīng)膜蛋白受體結(jié)合形成毒素—受體復(fù)合物而介導(dǎo)LC入胞；LC為BoNT/A的活性部位，具有金屬依賴性蛋白水解酶的活性。本文采用純化的重組BoNT/A HC作用于小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（mouse neuroblastoma neuro-2a cells， Neuro-2a）細(xì)胞株，檢測其對神經(jīng)突起生長變化的影響。

材料與方法

一、材料

Neuro-2a細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，胎牛血清和DMEM-HG購自美國Hyclone公司，人工重組BoNT/A HC來自美國List Biological Laboratories公司，鼠抗GT1b單克隆抗體購自美國Merck Millipore公司，兔抗SV2多克隆抗體購自德國Synaptic Systems GmbH公司，Alexa Fluro 488標(biāo)記的驢抗鼠及Alexa Fluro 488標(biāo)記的驢抗兔均購自美國Invitrogen Corporation公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：Neuro-2a細(xì)胞置于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM-HG培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)，每隔2 d進(jìn)行半換液1次。待細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部的80%時胰酶消化細(xì)胞配成細(xì)胞懸液備用。

2.免疫熒光法：將Neuro-2a細(xì)胞以1 × 104個細(xì)胞/孔接種到已鋪被多聚賴氨酸96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)一定時間后吸棄培養(yǎng)液，預(yù)冷PBS（4℃）洗滌2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞室溫60 min。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌（5 min × 3次），0.1% Trixton X-100室溫透膜10 min，10%正常驢血清封閉1 h，分別加入鼠抗GT1b單克隆抗體（1：800）、兔抗SV2多克隆抗體（1：800），濕盒中4℃冰箱孵育過夜。次日PBS洗滌，加入Alexa Fluro 488標(biāo)記的驢抗鼠（1：500）及Alexa Fluro 488標(biāo)記的驢抗兔（1：500）熒光二抗，濕盒內(nèi)室溫避光孵育1 h，PBS洗滌。適量的含有DAPI的長效抗衰敗熒光封片劑覆蓋于細(xì)胞表面置于Olympus激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.BoNT/A HC作用后Neuro-2a細(xì)胞突起測定：細(xì)胞接種后隨機(jī)分為對照組和實驗組（0.01 nmol/L組、0.1 nmol/L組、1 nmol/L組和10 nmol/L組）每組8個孔，于細(xì)胞貼壁生長后4 h時，實驗組加入不同濃度的BoNT/A HC，陰性對照組加入等劑量的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，分別于給藥后24 h、48 h和72 h時將細(xì)胞置于相差倒置顯微鏡攝影，每孔隨機(jī)視野拍攝2 ～ 3張圖片，每組共20張圖片，用于細(xì)胞突起的測定，包括：（1）具有突起的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例（%）；（2）計數(shù)細(xì)胞突起總數(shù)；（3）測量神經(jīng)突起長度。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

神經(jīng)突起的長度采用Cell Sens Entry軟件進(jìn)行測量（單位：μm），實驗數(shù)據(jù)（具有突起的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例、神經(jīng)突起的總數(shù)量以及神經(jīng)突起長度）以±s表示。數(shù)據(jù)經(jīng)GraphPad Prism 5.0 One-way ANOVA分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)BoNT/A HC相關(guān)受體

應(yīng)用SV2免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到從Neuro-2a接種于培養(yǎng)板后的1 ～ 5 h SV2陽性染色呈漸強(qiáng)的趨勢，且從開始時的胞膜附近逐漸增強(qiáng)呈現(xiàn)灶狀強(qiáng)陽性區(qū)。Neuro-2a細(xì)胞接種1 h即可看到SV2陽性染色，主要集中于胞膜附近，部分細(xì)胞可見SV2在細(xì)胞膜附近形成灶性強(qiáng)陽性區(qū)，隨培養(yǎng)時間的延長SV2表達(dá)呈現(xiàn)堅強(qiáng)的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)時間達(dá)到4 h時，可見Neuro-2a細(xì)胞呈SV2免疫染色強(qiáng)陽性，部分陽性聚集局部區(qū)域呈現(xiàn)灶性陽性團(tuán)塊（圖1）。

采用抗GT1b抗體對不同時間點Neuro-2a細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，觀察Neuro-2a細(xì)胞上GT1b的分布及含量發(fā)現(xiàn)，Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)GT1b，且GT1b主要分布于細(xì)胞膜區(qū)域和細(xì)胞突起；隨培養(yǎng)時間的延長GT1b的含量呈逐步增多的趨勢（圖2）。

二、BoNT/A HC刺激Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起再生

根據(jù)SV2及GT1b在Neuro-2a細(xì)胞的表達(dá)情況，確定加入BoNT/A HC的時間為細(xì)胞接種后4 h。觀察BoNT/A HC作用不同時間后Neuro-2a細(xì)胞突起生長情況。

1.具有突起的Neuro-2a細(xì)胞百分比：不同濃度的BoNT/A HC作用后，與對照組相比具有突起的Neuro-2a細(xì)胞百分比增長不盡相同，如圖3所示。0.1 nmol/L BoNT/A HC作用24 h后，具有突起的Neuro-2a細(xì)胞百分比（20.61 ± 4.87）%較對照組（15.27 ± 3.56）%明顯增多，而1 nmol/L和10 nmol/L濃度時則為負(fù)增長［分別為（15.08 ± 5.27）%和（12.65 ± 5.65）%］。隨著BoNT/A HC的作用時間延長，具有突起的細(xì)胞百分比有增加趨勢，其中以0.1 nmol/L組增加最為明顯，如表1所示。

2. BoNT/A HC 影響下神經(jīng)突起平均數(shù)量的變化：加入低濃度（0.01 nmol/L、0.1 nmol/L）BoNT/ A HC作用不同時間后，每個突起細(xì)胞的平均突起數(shù)量均比對照組增多，以0.1 nmol/L組增加最為明顯；加入高濃度（1 nmol/L、10 nmol/L）BoNT/A HC后與對照組相比突起數(shù)量變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。沒有BoNT/A HC影響時，三個時間細(xì)胞的平均突起數(shù)量［24 h為（1.68 ± 0.99）個，48 h為（1.82 ± 1.13）個，72 h為（1.84 ± 0.96）個］差異無統(tǒng)計學(xué)意義，加入0.1 nmol/L BoNT/A HC后，突起的平均數(shù)量依次為（2.18 ± 1.24）個、（2.28 ± 1.11）個、（2.33 ± 1.22）個，與同一時間點對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），如表2所示。

圖1　激光共聚焦顯微鏡下觀察不同培養(yǎng)時間點Neuro-2a細(xì)胞表達(dá)SV2及分布特征（免疫熒光染色×100）

圖2　激光共聚焦顯微鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞在不同時間點GT1b的表達(dá)及分布情況（免疫熒光染色法×100）

3. BoNT/A HC對Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起長度的影響：采用Olympus Cell Sens Entry軟件對Neuro-2a細(xì)胞的突起進(jìn)行長度測定，結(jié)果顯示：加入低濃度（0.01 nmol/L，0.1 nmol/L）的BoNT/A HC后神經(jīng)突起的長度比對照組長，尤以0.1 nmol/ L組增長明顯。其中0.1 nmol/L BoNT/A HC作用48 h、72 h后細(xì)胞的突起長度均比對照組顯著增加（分別為70.12 ± 6.73 μm、89.63 ± 7.75 μm、45.07 ± 3.57 μm），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），如表3所示。而加入高濃度（1 nmol/L，10 nmol/L）的BoNT/A HC后神經(jīng)突起的長度與對照組相比增長不明顯甚至出現(xiàn)抑制效應(yīng)。

表1　不同濃度BoNT/A HC作用后不同時間突起細(xì)胞的百分比（%，±s）

表1　不同濃度BoNT/A HC作用后不同時間突起細(xì)胞的百分比（%，±s）

注：與同一時間對照組相比，aP ＜ 0.05；與同一時間0.1 nmol/l組相比，bP ＜ 0.05，；與同濃度24 h組相比，cP ＜ 0.05

分組24 h48 h72 h對照組15.27 ± 3.5619.40 ± 4.1921.89 ± 6.33 0.01 nmol/L17.71 ± 5.05 20.11 ± 5.70b23.97 ± 7.49c0.1 nmol/L 20.61 ± 4.87a23.88 ± 6.88a26.43 ± 7.15a1 nmol/L 15.08 ± 5.27b16.47 ± 5.78b17.39 ± 5.93b10 nmol/L 12.65 ± 5.65b12.94 ± 3.76a13.36 ± 5.27a

表2　BoNT/A HC作用后每個突起細(xì)胞的平均突起數(shù)量（個，±s）

表2　BoNT/A HC作用后每個突起細(xì)胞的平均突起數(shù)量（個，±s）

注：與同一時間對照組相比，aP ＜ 0.05；與同一時間0.1nmol/L組相比，bP ＜ 0.05

分組24 h48 h72 h對照組1.68 ± 0.991.82 ± 1.131.84 ± 0.96 0.01 nmol/L1.84 ± 1.071.95 ± 1.051.99 ± 1.22 0.1 nmol/L 2.18 ± 1.24a2.28 ± 1.11a2.33 ± 1.22a1 nmol/L 1.65 ± 0.85b1.74 ± 0.95b1.84 ± 1.16b10 nmol/L 1.64 ± 0.85b1.70 ± 0.90b1.60 ± 1.16b

表3　0.1 nmol/L的HC作用不同時間后突起細(xì)胞的平均突起長度（μm，±s）

表3　0.1 nmol/L的HC作用不同時間后突起細(xì)胞的平均突起長度（μm，±s）

注：與對照組相比，aP ＜ 0.05；與同一時間0.1nmol/L組相比，bP ＜ 0.05

分組24 h48 h72 h對照組23.38 ± 27.1345.07 ± 42.2856.70 ± 66.11 0.01 nmol/L28.17 ± 26.6648.23 ± 46.81 62.61 ± 76.74b0.1 nmol/L38.76 ± 38.11 70.12 ± 74.98a89.63 ± 88.00a1 nmol/L33.75 ± 39.1152.38 ± 57.73 61.59 ± 77.90b10 nmol/L18.95 ± 21.71 38.33 ± 53.78b45.96 ± 67.60b

討　論

Neuro-2a細(xì)胞株，又稱小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，是建立于A型白化小鼠的自發(fā)性腫瘤細(xì)胞株，具有神經(jīng)干細(xì)胞的特性，因其具有細(xì)胞成分均一、無其他細(xì)胞干預(yù)的特點，故已經(jīng)替代神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)用于神經(jīng)突起的實驗研究［16］。

BoNT/A導(dǎo)致宿主中毒的機(jī)理主要是由于毒素分子可與神經(jīng)末梢前膜的特異性毒素結(jié)合蛋白（受體）結(jié)合，通過毒素-受體復(fù)合物內(nèi)吞入胞而發(fā)揮其阻斷神經(jīng)遞質(zhì)釋放的毒性作用［13，17］。BoNT/A的分子由兩條鏈組成，即HC和LC，二者通過二硫鍵相互連接。其中HC是毒素的抗原成分，負(fù)責(zé)識別和結(jié)合特定的神經(jīng)細(xì)胞表面受體，而LC則是毒素的酶活性成分，隨毒素—受體復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞漿，選擇性裂解突觸前膜上的SNARE蛋白（soluble N-ethylamleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNAP）中分子量為25 kDa的相關(guān)蛋白，SNAP-25［18-19］，裂解后的SNAP-25喪失了介導(dǎo)突觸囊泡膜與細(xì)胞膜融合的作用，使神經(jīng)遞質(zhì)—乙酰膽堿的釋放受抑，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)肌肉麻痹。BoNT/A HC同時包含了兩個功能域：C端的受體結(jié)合域和N端的介導(dǎo)域。目前已經(jīng)證實，宿主細(xì)胞表面有兩種可與BoNT/ A HC結(jié)合的成分，一種是BoNT/A HC的高親和力受體，稱為突觸囊泡蛋白2（Synaptic vesicle 2，SV2）［8-13］，另一種是BoNT/A HC的低親和力受體，稱為神經(jīng)節(jié)苷脂（ganglioside），主要是三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂1b（Trisialoganglioside 1b， GT1b）［14］。GT1b與HC結(jié)合可促進(jìn)SV2在細(xì)胞膜的漂移及簇集以加快毒素與受體的結(jié)合。然而，Neuro-2a細(xì)胞是否具有BoNT/A HC結(jié)合的相應(yīng)蛋白目前尚無報道。本研究結(jié)果證實，Neuro-2a細(xì)胞含有BoNT/A HC結(jié)合的相應(yīng)膜結(jié)合蛋白或受體，可以用于BoNT/A相關(guān)體外實驗。

已有研究證實BoNT/A全毒素能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)的原代運(yùn)動神經(jīng)元神經(jīng)軸突的生長［19］，其機(jī)理可能是毒素與細(xì)胞膜上相應(yīng)受體結(jié)合后激活了細(xì)胞內(nèi)與再生相關(guān)的信號通路（譬如PI3K/AKT信號通路以及MAPK/ERK信號通路）從而促進(jìn)了細(xì)胞神經(jīng)突起的生長，基于HC為BoNT/A與宿主細(xì)胞結(jié)合的主要分子成分，本實驗利用人工重組的HC，運(yùn)用不同濃度的BoNT/A HC作用Neuro-2a細(xì)胞，觀察對細(xì)胞突起生長的影響，結(jié)果顯示：BoNT/A HC促進(jìn)Neuro-2a細(xì)胞突起生長的作用隨濃度的增加而增強(qiáng)，但當(dāng)濃度增加至一定程度后發(fā)現(xiàn)促進(jìn)作用減弱甚至出現(xiàn)抑制現(xiàn)象（10 nmol/L），這種低濃度促進(jìn)而高濃度抑制的現(xiàn)象與毒素反應(yīng)曲線相符。一定劑量（0.1 nmol/L）的BoNT/A HC作用于培養(yǎng)4 h的Neuro-2a細(xì)胞發(fā)現(xiàn)HC具有促進(jìn)細(xì)胞突起生成及刺激神經(jīng)突起增長的作用，結(jié)果與以往采用BoNT/A全毒素或滅活輕鏈的BoNT/A促進(jìn)神經(jīng)突起再生的實驗結(jié)果基本吻合［7］。提示BoNT/A HC有可能促使幼稚細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)分化，即具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞成熟分化的潛能，但需要今后進(jìn)一步證實。

本研究中發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)液內(nèi)生長的Neuro-2a細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長有突起細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比、有突起細(xì)胞的突起總數(shù)量以及突起的總長度均有所增加；當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)加入不同濃度的BoNT/A HC后，對Neuro-2a細(xì)胞神經(jīng)突起的生長起到了一定的干預(yù)作用：當(dāng)BoNT/A HC的濃度為0.01、0.1 nmol/L時有突起細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比、有突起細(xì)胞的突起總數(shù)量以及突起總長度較對照組都明顯增加，尤以0.1nmol/L濃度表現(xiàn)明顯，但當(dāng)BoNT/A HC的濃度達(dá)到10 nmol/L時，上述指標(biāo)則較相應(yīng)對照組減少，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是多方面的，譬如：作為藥物，BoNT/A HC有可能有一個最佳的劑量范圍，超過這個范圍效應(yīng)不再顯示，或者相對較高的劑量對細(xì)胞的毒性作用較強(qiáng)，又或者商品化的BoNT/A HC溶解在一定的佐劑后可能對細(xì)胞具有一定的副作用，隨著BoNT/A HC劑量的加大，佐劑的含量也相應(yīng)增加，從而造成對細(xì)胞的損傷，而其具體機(jī)制目前尚不清楚，需作進(jìn)一步的研究證實。

神經(jīng)系統(tǒng)的損傷在臨床上是一種較常見疾病，但對于損傷后神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)效果卻不盡如人意，故尋找促進(jìn)損傷后神經(jīng)系統(tǒng)功能的新藥（制劑）日漸成為人們研究的重點，而神經(jīng)系統(tǒng)功能的恢復(fù)除了神經(jīng)細(xì)胞自身的存活和功能正常以外，更重要的是神經(jīng)軸突的再生情況，包括再生的速度，再生軸突與周圍組織的連接情況，以及再生后的神經(jīng)軸突對相應(yīng)效應(yīng)器的支配情況等［19］。因此，本文的研究結(jié)果為臨床尋找促進(jìn)神經(jīng)突起再生的新藥（制劑）提供了思路。然而，由于實驗的局限性，今后還需就HC促進(jìn)神經(jīng)突起再生進(jìn)行更進(jìn)一步的研究，譬如：（1）HC促進(jìn)神經(jīng)突起再生的細(xì)胞內(nèi)信號通路；（2）加大BoNT/A HC劑量或延長BoNT/A HC用藥時間是否對細(xì)胞的其它功能代謝產(chǎn)生影響；（3）毒素的這種促再生作用在體內(nèi)和體外的關(guān)聯(lián)程度如何等都需要在今后的實驗中加以探討。

1 郭若愚， 任圓圓， 朱金土. A型肉毒毒素臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］. 世界中西醫(yī)結(jié)合雜志， 2011， 6（4）：350-352.

2 代娟麗， 張德仁. A型肉毒毒素與神經(jīng)病理性疼痛［J］.實用疼痛學(xué)雜志， 2007， 3（6）：455-458.

3 Comella JX， Molgo J， Faille L. Sprouting of mammalian motor nerve terminals induced by in vivo injection of botulinum type-D toxin and the functional recovery of paralyzed neuromuscular junctions［J］. Neurosci Lett， 1993，153（1）：61-64.

4 Juzans J， Comella JX， Molgo J， et al. Nerve terminal sprouting in botulinum type-A treated mouse levator auris longus muscle［J］. Neuromuscul Disord， 1996， 6（3）：177-185.

5 Foran PG， Davletov B， Meunier FA. Getting muscles moving again after botulinum toxin： novel therapeuti challenges［J］. Trends Mol Med， 2003， 9（7）：291-299.

6 Ko CP. Do nerve terminal sprouts contribute to functional recovery from botulinum neurotoxin A［J］. J Physiol， 2008，586（13）：3021-3021.

7 Coffield JA， Yan X. Neuritogenic actions of botulinum neurotoxin A on cultured motor neurons［J］. J Pharmacol Exp Therapeu， 2009， 330（1）：352-358.

8 Yu YZ， Ma Y， Chen YX， et al. Activity and immunogenic characterization of recombinant C-terminal quarter and half of the heavy chain of botulinum neurotoxin serotyoe A［J］. Human Vaccines， 2011， 7（10）：1090-1095.

9 Rummel A， Eichner T， Weil T， et al. Identification of the protein receptor binding site of botulinum neurotoxins B and G proves the double-receptor concept［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2007， 104（1）：359-364.

10 Dong M， Yeh F， Tepp WH， et al. SV2 is the protein receptor for botulinum neurotoxin A［J］. Science， 2006， 312（5773）：592-596.

11 Lalli G， Herreros J， Osborne SL， et al. Functional characterisation of tetanus and botulinum neurotoxins binding domains［J］. J Cell Sci， 1999， 112（16）：2715-2724.

12 Singh BR. Intimate details of the most poisonous poison［J］. Nat Struct Biol， 2000， 7（8）：617-619.

13 Benoit1 RM， Frey D， Hilbert M， et al. Structural basis for recognition of synaptic vesicle protein 2C by botulinum neurotoxin A［J］. Nature， 2014， 505（7481）：108-111.

14 Rummel A， Mahrhold S， Bigalke H， et al. The Hcc-domain of botulinum neurotoxins A and B exhibits a singular ganglioside binding site displaying serotype specific carbohydrate interaction［J］. Molecular Microbiology， 2004，51（3）：631-643.

15 Baldwin MR， Barbieri J. Asscciation of botulinum neurotoxins with synaptic vesicle protein complexes［J］. Toxicon， 2009， 54（5）：570-574.

16 馬志奎， 趙煒疆. Neuro-2a細(xì)胞替代神經(jīng)元原代培養(yǎng)進(jìn)行神經(jīng)軸突測量實驗研究［J］. 中國實用神經(jīng)疾病雜志，2012， 15（10）：4-6.

17 Montal M. Botulinum neurotoxin：a marvel of protein design［J］. Annu Rev Biochem， 2010， 79：591-617.

18 Peng L， Tepp WH， Johnson EA， Dong M. Botulinum Neurotoxin D Uses synaptic Vesicle Protein SV2 and Gangliosides as Receptors［J］. PLoS Pathog， 2011， 7（3）：e1002008.

19 王然蕓， 郭永明， 郭義. 周圍神經(jīng)再生和修復(fù)的研究進(jìn)展［J］. 天津中醫(yī)藥， 2011， 28（3）：260-261.

Feasibility of mouse neuroblastoma neuro-2a cells cell line as a model for the study of botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain in vitro x

ischemiaQiao Huan2， Li Xiaqing1. 1Department of Pathophysiology， Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China；2Department of orthopedics， the Central Hospital of Linfen， Linfen 041000，China

Li Xiaqing， Email：xqli2013@126.com

Objective To investigate the feasibility of neuro-2a cell line for evaluation of bioactivity of botulinum neurotoxin serotype-A heavy chain （BoNT/A HC）. Methods The expression levels of synaptic vesicle 2 （SV2） and trisialoganglioside 1b （GT1b）that were two essential membranous components of BoNT/A HC receptors were detected by immunofluorescence on the Neuro-2a cells. Cells were treated by DMEM-HG mediumwith or without BoNT/A HC （which were divided into control group， 0.01 nmol/L group， 0.1 nmol/L group， 1 nmol/L group and 10nmol/L group in 96-well culture plates） for 24， 48， or 72 hours respectively. The percentage of cells with neurites， the average number of neurites and the average length of neurites after BoNT/A -HC treatment were measured. All the data were analyzed by GraphPad Prism 5.0 One-way ANOVA.Results SV2 and GT1b proteins were expressed in Neuro-2a cells. BoNT/A HC at low dosage （0.1 nmol/L） could promote the generation and growth of neurites of Neuro-2a cells under DMEM-HG medium for 24 hours. The percentage of cells with neurites ［（20.61 ± 4.87）%&（15.27 ± 3.56）%， P ＜ 0.001］，F(xiàn) = 37.7）； the total number of neurites （2.18 ± 1.24 &1.68 ± 0.99， P ＜ 0.001， F = 9.54）， and the average length of neurites ［（38.76 ± 38.11）μm& （23.38 ± 27.13）μm］ were significantly different（P ＜ 0.05） compared with controls. Longer treatment time （48 and 72 hours） further increased the percentage of cells with neurites， the total number of neurites or the average length of neurites. However， BoNT/A HC at high dosages （1 nmol/L and 10 nmol/L） was ineffective（P ＞ 0.05）. Conclusion Neuro-2a cells could be used as acell model for BoNT/A HC study in vitro， and BoNT/A HC at low dosage （0.1 nmol/L） was most effective in promoting neurite production.

Botulinum toxins； synapsins； gangliosides

2015-08-11）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2015.04.004

國家自然科學(xué)基金面上項目（81171178）；山西省自然科學(xué)基金項目（2012011036-3）；山西省留學(xué)人員科研資助項目（2012-047）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室1；041000 臨汾，臨汾市中心醫(yī)院骨科2

李夏青，Email：xqli2013@126.com