于國(guó)龍1★ 秦冰2 鄢心革1 刁麗梅1 李杰1 周平平3 顏瑾1 李艷1 楊放1 林鵬1

·論著·

廣東男男性行為HIV-1感染者中耐藥情況及基因型分布

于國(guó)龍1★ 秦冰2 鄢心革1 刁麗梅1 李杰1 周平平3 顏瑾1 李艷1 楊放1 林鵬1

目的了解2013年在廣東省新發(fā)現(xiàn)的男男性行為（man have sex with man，MSM）人類免疫缺陷病毒-I（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）感染者中基因型耐藥情況及亞型分布。方法采用In-House方法，擴(kuò)增HIV-l pol基因蛋白酶區(qū)（protease region，PR）基因全長(zhǎng)和逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（reverse transcriptase region，RT）基因部分片段，通過HIV-1耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得個(gè)體耐藥突變位點(diǎn)、基因亞型及藥物耐受情況。結(jié)果在203人中，HIV-1病毒載量拷貝數(shù)中值為4.27×104拷貝/mL，平均值拷貝數(shù)為9.37×104拷貝/mL；高度基因型耐藥病例2人，占1.2％；中度耐藥1人，占0.6％；低度耐藥7人，占4.1％；潛在耐藥26人，占15.4％。PR區(qū)未見主要耐藥突變；RT區(qū)主要耐藥突變有：K70R、M184V、T215IT、K219E、K103KN、V106I、E138EG、V179E/D；出現(xiàn)了針對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC及FTC的高度耐藥1例，占0.6％；針對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑EFV及NVP高度耐藥1例，占0.6％；亞型方面，主要以CRF01_AE及CRF_BC重組亞型為主，同時(shí)B亞型在MSM人群中占20.1％。結(jié)論廣東省目前MSM感染者中HIV-1高度耐藥毒株尚處于低流行，潛在耐藥毒株可能已經(jīng)在人群中傳播；MSM人群中以CRF01_AE、CRF_BC重組亞型及B亞型毒株流行為主。

男男性行為；高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療；HIV-1耐藥

隨著艾滋病病毒在我國(guó)的傳播，目前傳播途徑已經(jīng)從吸毒為主轉(zhuǎn)為經(jīng)性傳播為主。廣東省作為全國(guó)重要的流行地區(qū)之一，經(jīng)性傳播已成為人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）傳播的主要方式，2013年經(jīng)性傳播比例達(dá)到84.9％，其中男男性傳播比例從2008年的6.0％逐年上升到27.1％［1］。由于抗病毒治療在我國(guó)的廣泛開展，必然會(huì)出現(xiàn)耐藥毒株在人群中的傳播。對(duì)新近或新發(fā)人群的耐藥監(jiān)測(cè)，是了解耐藥毒株在人群中傳播的主要方式之一。既往調(diào)查顯示，男男性行為者（man have sex with man，MSM），有可能出現(xiàn)更高的原發(fā)性耐藥比例［2］。在我國(guó)的MSM中HIV原發(fā)耐藥水平在4.9％，蛋白酶抑制劑耐藥是主要的耐藥形式，且存在著地區(qū)分布不均等因素［3］。對(duì)深圳市2010年的MSM人群調(diào)查顯示，該人群中原發(fā)性耐藥仍處于較低水平［4］，但對(duì)近年該人群的研究資料較少。本研究擬對(duì)2013年我省部分地區(qū)新發(fā)現(xiàn)的MSM感染者進(jìn)行基因型耐藥檢測(cè)，了解該人群中原發(fā)性耐藥情況。

1　材料方法

1.1目標(biāo)人群

廣東省2013年男男性行為人群新發(fā)感染評(píng)估項(xiàng)目中的新發(fā)現(xiàn)的HIV感染者203人。調(diào)查對(duì)象入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18周歲及以上，平均年齡29.6歲；最近一年內(nèi)與同性發(fā)生過口交或肛交性行為的男性；在知情同意基礎(chǔ)上自愿接受問卷調(diào)查和HIV相關(guān)檢測(cè)。

1.2病毒載量檢測(cè)

運(yùn)用瑞士ROCHe Cobas Amplicor全自動(dòng)病毒載量檢測(cè)儀及配套的Cobas Amplicor HIV-1Monitor Test檢測(cè)試劑盒（瑞士，ROCHe公司），檢測(cè)HIV-1病毒載量。樣本進(jìn)入儀器后，核酸提取及載量檢測(cè)由載量?jī)x自動(dòng)完成。詳細(xì)過程見試劑盒操作說明書。

1.3病毒RNA提取和目的基因擴(kuò)增

所有檢測(cè)到病毒載量的樣本，用QIAamp Viral RNA Extraction Mini kit試劑盒（德國(guó)，Qiagen公司），在QIAGEN QIAcube自動(dòng)核酸提取儀上提取HIV-1病毒RNA，-70℃保存待用。QIAGEN公司一步法RT-PCR試劑盒（德國(guó)，Qiagen公司）進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，總反應(yīng)體系50 μL，含RTPCR Buffer Mg2+離子濃度2.5 mmol/L、dNTP 400 μmol/L、PRO-1 0.6 μmol/L、RT-20 0.6 μmol/L、酶混合物2 U、cDNA 5 μL；反應(yīng)條件：50℃30 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，95℃15min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶；94℃變性3 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min 30 s，共35個(gè)循環(huán)。取第一輪PCR產(chǎn)物5 μL作為反應(yīng)模板，運(yùn)用QIAGEN Taq PCR Master Mix試劑盒，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：總體系50 μL，包含TaqMix 25 μL、MAW-26 0.4 μmol/L、RT-22 0.4 μmol/L及首輪PCR產(chǎn)物5 μL；反應(yīng)條件為：94℃變性3 min后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均采用國(guó)家疾控中心推薦的In-house方法使用的擴(kuò)增及測(cè)序引物，見表1。

表1　基因型耐藥檢測(cè)使用引物Table 1The primers for detected the HIV-1 genotypic resistance

1.4基因測(cè)序及基因型耐藥分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與目的擴(kuò)增片段大小一致，將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京諾賽基因有限公司測(cè)序；測(cè)定后的序列用sequencer5.0軟件進(jìn)行拼接、編輯、校正。將整理后的序列提交Stanford HIV Drug Resistance Database［5］行基因型耐藥分析，獲得耐藥突變位點(diǎn)、耐藥類型及毒株的亞型結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1病毒載量檢測(cè)結(jié)果

在203份樣本中，18份樣本感染者因?yàn)闃颖玖坎粔蛭催M(jìn)行病毒載量檢測(cè)，但進(jìn)行了耐藥基因型檢測(cè)，185份進(jìn)行病毒載量檢測(cè)。其中病毒載量拷貝數(shù)小于1×103/mL的樣本占3.2％（6/185）；病毒載量拷貝數(shù)在1×103～1×104/mL的樣本占8.6％（16/185）；病毒載量拷貝數(shù)在1×104～1× 105/mL的樣本占64.3％（119/185）；拷貝數(shù)為1× 105～1×106/mL的樣本占23.2％（43/185）；病毒載量拷貝數(shù)大于1×106/mL的樣本占0.5％（1/ 185）。病毒載量檢測(cè)中值：拷貝數(shù)為4.27×104/ mL，平均值：拷貝數(shù)為9.36×104/mL。

2.2PCR擴(kuò)增及基因型耐藥結(jié)果

有效擴(kuò)增并成功測(cè)序進(jìn)行基因型耐藥分析169人，擴(kuò)增成功率為89.8％（169/203）；總體樣本中高度耐藥2例，占1.2％；中度耐藥1例，占0.6％；低度耐藥7例，占4.1％；潛在耐藥26例，占15.5％；其中蛋白酶抑制劑（protease inhibitors，PIs）潛在耐藥2人，占1.2％；PIs低度耐藥病例3人，占1.8％；PIs區(qū)未見中度及高度耐藥病例，核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NRTIs）潛在及低度耐藥各3人，分別占1.8％；高度及中度耐藥各1人，各占0.59％；非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors，NNRTIs）潛在耐藥21人，占12.4％，低度耐藥2人，占1.2％，未見中度耐藥，高度耐藥1例占0.6％。不同類型藥物的耐藥程度及比例見表2。

表2　不同類型藥物耐藥程度及所占比例（檢測(cè)人數(shù)n=169）Table 2The percent of HIV-1 genotypic resistance in MSM（total number n=169）

2.3常見耐藥突變耐藥藥物類型

核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶編碼區(qū)導(dǎo)致高度耐藥突變位點(diǎn)為M184MV、T215IT，各占0.59％（1/169）；非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑導(dǎo)致高度耐藥突變K103KN占0.59％。在蛋白酶編碼區(qū)，尚未出現(xiàn)高度耐藥突變，其它類型突變及突變百分比詳見表3。在耐藥藥物類型方面，針對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑拉米夫定（lamivudine，3TC）及恩曲他濱（emtricitabine，F(xiàn)TC）的高度耐藥1例，針對(duì)非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑依法韋侖（efavirenz，EFV），奈韋拉平（nevirapine，NVP）高度耐藥1例，未見對(duì)其他類型藥物的高度耐藥，針對(duì)出現(xiàn)的其它不同類型藥物的中度及潛在耐藥結(jié)果見表4。

2.4HIV-1亞型比例

本次所有測(cè)序成功樣本中，亞型結(jié)果均根據(jù)斯坦福耐藥數(shù)據(jù)庫(kù)中直接給出的基因亞型來進(jìn)行亞型分類，由于該亞型分類僅僅能將BC亞型分出，不能區(qū)分07BC及08BC亞型，所以本研究中僅給出CRF_BC亞型的比例。其中，CRF_01AE亞型78例，占46.2％（78/169）；B亞型34例，占20.1％（34/169），CRF_BC亞型56例，占33.2％（56/169）；其它1例，占0.6％（1/169）。

表3　常見耐藥突變類型及比例Table 3The genotype mutation and percent in MSM populations

表4　針對(duì)不同類型藥物耐藥數(shù)及耐藥水平Table 4The drug resistance level and number of patients with drug resistance

3　討論

HIV-1病毒在男男性行為人群中目前已經(jīng)出現(xiàn)高流行的趨勢(shì)，我國(guó)的哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該人群的發(fā)病率已經(jīng)處于首位，高于其它高危人群。既往我國(guó)MSM人群研究資料報(bào)道，HIV-1原發(fā)耐藥在4.9％左右，蛋白酶抑制區(qū)的耐藥發(fā)生率比較高［3］，廣東地區(qū)MSM人群中是否也存在這一現(xiàn)象，近年的相關(guān)研究資料較少。既往的研究資料表明，廣東地區(qū)MSM人群中的耐藥發(fā)生率2％～3％之間［4，6］，低于全國(guó)的研究報(bào)道，逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)（reverse transcriptase region，RT）區(qū)耐藥檢出率僅2.79％，蛋白酶區(qū)（protease region，PR）的耐藥程度更低［6］。這些研究資料的差異可能是由于時(shí)間及人群選擇的差異造成。隨著HIV-1的疫情在MSM人群中的快速傳播，及時(shí)了解廣東地區(qū)MSM人群中的HIV-1耐藥流行情況，亞型及藥物耐藥類型，對(duì)于地區(qū)HIV-1治療及防控策略的制定與調(diào)整具有重要意義。

本研究通過對(duì)廣東省2013年新報(bào)告的MSM中HIV-1感染者的基因型耐藥分析發(fā)現(xiàn)，目前在該地區(qū)的MSM感染者中，高度耐藥仍然處于低流行水平。本研究中出現(xiàn)的兩例高度耐藥分別為針對(duì)核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑3TC及FTC及非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑EFV和NVP的高度耐藥。導(dǎo)致核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑高度耐藥的基因突變位點(diǎn)為M184MV、T215IT，而導(dǎo)致非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑高度耐藥的基因突變位點(diǎn)為K103KN，與之前針對(duì)廣東省長(zhǎng)期治療病人中出現(xiàn)的高度耐藥類型及突變位點(diǎn)一致［7］。針對(duì)這一結(jié)果的可能解釋之一，這些原發(fā)性的毒株可能來源于長(zhǎng)期治療人群中的耐藥毒株。在針對(duì)藥物耐藥類型方面，HIV-1蛋白酶區(qū)的耐藥突變?nèi)蕴幱谳^低水平，不同于之前的研究報(bào)道［3］，與本省內(nèi)深圳地區(qū)基本相同［6］。在非核苷類逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑方面，本研究人群中的潛在耐藥明顯增高，達(dá)到了12.4％（表2）。雖然高度耐藥及低度耐藥在MSM人群中仍然處于低流行水平，但該人群中總體潛在耐藥比例達(dá)到了15.4％（表2），已經(jīng)遠(yuǎn)超2012年深圳地區(qū)［6］及我國(guó)其他地區(qū)MSM人群中報(bào)道的耐藥水平［4，6，8-9］。如果按照耐藥警戒線檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)判定，當(dāng)某一地區(qū)HIV-1耐藥水平大于15％，說明該地區(qū)已近處于耐藥的高流行水平。按照此標(biāo)準(zhǔn)判定，在該人群中，潛在的耐藥突變毒株可能已經(jīng)開始在人群中出現(xiàn)傳播。由于目前MSM人群HIV-1發(fā)病率高居首位［1］，其人群性活躍程度較高，一旦出現(xiàn)耐藥毒株，容易出現(xiàn)在人群中的快速傳播，所以在MSM人群中進(jìn)行耐藥常規(guī)的監(jiān)測(cè)及檢測(cè)已經(jīng)非常必要。

在基因亞型方面，MSM人群中HIV-1流行毒株主要以CRF_01AE亞型為主，占46.2％，為MSM中的主要流行亞型；其次為BC重組亞型，占33％；該MSM人群中處于第三位的流行毒株為B亞型，占20.1％，與我國(guó)其它地區(qū)MSM中流行亞型所占比例大致相同［10-12］。但與廣東深圳地區(qū)2008-2009年發(fā)現(xiàn)的MSM HIV-1感染者中所報(bào)道的B亞型比例（47.8％）差異較大［6］。本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行的對(duì)廣東省2013年新發(fā)現(xiàn)的HIV-1感染者進(jìn)行分子流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，目前廣東省新發(fā)現(xiàn)的HIV-1感染者中，CRF01_AE占53.1％、CRF07_BC占26.0％和CRF08_BC占8.6％，是廣東省主要流行的3種亞型，B亞型僅僅占1.2％。這也說明B亞型在MSM人群中不同于普通人群及吸毒人群［13］，是主要的流行毒株之一。造成這種毒株差異的原因之一可能為，MSM人群中性活躍程度較高，B亞型毒株在該人群中所占的比例短期內(nèi)應(yīng)不會(huì)明顯下降。

綜上所述，廣東省目前MSM感染者中HIV-1高度耐藥毒株尚處于低流行，潛在耐藥毒株可能已經(jīng)在人群中傳播；MSM人群中以CRF01_AE、CRF_BC重組亞型及B亞型毒株流行為主。

［1］廣東省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).2014年艾滋病工作情況通報(bào)［EB/OL］.http：//www.gdwst.gov.cn/a/zhgg/ 2014120112585.html，2014-12-01/2015-03-06.

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Investigation of HIV-1 drug resistance and gene subtype prevalence in man have sex with man in Guangdong province

YU Guolong1，QIN Bing2，YAN Xinge1，DIAO Limei1，LI Jie1，ZHOU Pingping3，YAN Jin1，LI Yan1，YANG Fang1，LIN Peng1
（1.Institute of AIDS Control and Prevention，Guangdong Center for Disease Control and Prevention，Guangzhou，Guangdong，China，510300；2.The Preventive Drugs Department of Guangdong Provincial Institute of Biological Products and Drugs，Guangzhou，Guangdong，China，510440；3.The Center Lab of Guangdong Provincial Institute of Public Health，Guangzhou，Guangdong，China，511430）

ObjectiveTo estimate the drug resistance and subtype distribution among human immunodeficiency virus 1（HIV-1）-infecters（man have sex with man，MSM）in Guangdong province in 2013. MethodsThe full length of HIV-1 protease gene and part of reverse transcriptase gene were amplified with the In-house method.The obtained sequences were blasted with the stanford HIV-1 drug resistance database to get the drug resistance mutations，gene subtypes and drug resistance.ResultsIn 203 patients，the median viral load was 4.27×104copies/mL，and the average value was 9.36×104copies/mL.It was showed that 2individuals（1.2％）were highly resistant，1 individual（0.6％）was intermediate resistant，7 individuals（4.1％）were with low level of resistance，and 26 individuals（15.4％）were with potential low level of resistance.No major resistance mutation was found in protease region（PR）.The major drug resistance mutations in reverse transcriptase region（RT）were K70R，M184V，T215IT，K219E，K103KN，V106I，E138EG and V179E/D.One high drug resistance to 3TC and FTC was found in nucleoside reverse transcriptase inhibitor（NRTI），and one high drug resistance to NVP and EFV was found in non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor（NNRTI）.The high drug resistance in NRTI and NNRTI was 0.6％and 0.6％，respectively.The CRF_01AE was the main subtype among the MSM population，which was followed by CRF_BC，and the proportion of B subtype in MSM population was 20.1％.ConclusionAlthough the HIV-1 strains with high resistance level are now prevailing at a low level，the potential resistance viral strains might have been prevailing among MSM population.And the CRF01_AE，CRF_BC and B subtype are the prevalent HIV-1 subtypes among the MSM population.

Man have sex with man；Highly active antiretroviral therapy；HIV-1 drug resistance

·綜述·

“十二五”重大科技專項(xiàng)（2012ZX10004902）；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金（WSTJJ2014A088）

1.廣東省疾病預(yù)防控制中心艾滋病預(yù)防控制所，廣東，廣州510300 2.廣東省生物制品與藥物研究所預(yù)防藥物研究室，廣東，廣州510440 3.廣東省公共衛(wèi)生研究院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東，廣州511430

于國(guó)龍，E-mail：guolongy@126.com