梁培1 呂剛1 周曉君2 陳新新1 陳小靜1 符瑞佳1★

·論著·

曼氏迭宮絳蟲(chóng)annexinB8的生物信息學(xué)分析和基因克隆

梁培1 呂剛1 周曉君2 陳新新1 陳小靜1 符瑞佳1★

目的通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)曼氏迭宮絳蟲(chóng)annexinB8（SmannexinB8）的生物學(xué)特征，及潛在功能和結(jié)構(gòu)，并且進(jìn)行基因克隆，為下一步SmannexinB8參與宿主免疫調(diào)節(jié)研究提供依據(jù)。方法通過(guò)NCBI的ORF finder工具對(duì)SmannexinB8的開(kāi)放閱讀框進(jìn)行分析，利用ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行蛋白的物理化學(xué)參數(shù)、信號(hào)肽、跨膜螺旋、潛在分子生物學(xué)功能的預(yù)測(cè)，通過(guò)NCBI/BLAST對(duì)蛋白保守功能域進(jìn)行檢測(cè)。不同物種的annexin序列從NCBI網(wǎng)站獲取，并利用Vector NTI suit 8.0和TreeView軟件進(jìn)行分析。利用SWISS-MODEL網(wǎng)站和SPDBV 4.10軟件分析SmannexinB8蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)。此外，對(duì)SmannexinB8基因進(jìn)行擴(kuò)增，并克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+）。結(jié)果SmannexinB8是一個(gè)全長(zhǎng)基因，編碼347個(gè)氨基酸。蛋白由4個(gè)典型的annexin重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成，序列當(dāng)中沒(méi)有信號(hào)肽，是一個(gè)穩(wěn)定的可溶性蛋白分子。三維空間立體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示SmannexinB8是一個(gè)保守的蛋白。SmannexinB8與多房棘球絳蟲(chóng)、口膜殼絳蟲(chóng)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)以及人類(lèi)的annexin基因的同源性分別是68％，67％，65％，46％和40％。分子進(jìn)化分析顯示SmannexinB8與絳蟲(chóng)屬的親源性最近，而與其他物種，如吸蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物親源性較遠(yuǎn)。結(jié)論SmannexinB8可能具有抑制磷脂酶A2的活性，促進(jìn)細(xì)胞融合、參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和離子通道形成的功能，可能在參與宿主免疫調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵性的作用。

曼氏迭宮絳蟲(chóng)；annexin B8；生物信息學(xué)分析；多功能

曼氏迭宮絳蟲(chóng)是迭宮絳蟲(chóng)屬之一，其主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)和泰國(guó)［1］。裂頭蚴是曼氏迭宮絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，能夠?qū)е聡?yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病和威脅公共健康。在中國(guó)，超過(guò)1 000人感染了裂頭蚴，他們分別來(lái)自27個(gè)省、自治區(qū)和直轄市［2］。曼氏迭宮絳蟲(chóng)的終宿主是肉食哺乳動(dòng)物，包括狗和貓，第一中間宿主是橈足動(dòng)物，第二中間宿主是脊椎動(dòng)物，如爬行動(dòng)物、鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳動(dòng)物［3］。盡管有關(guān)于人感染曼氏迭宮絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的報(bào)道，但是人通常作為第二中間宿主［4］。人感染裂頭蚴主要是通過(guò)喝了含有裂頭蚴感染劍水蚤的生水或是食用感染有裂頭蚴的生青蛙肉或蛇肉。另外一個(gè)不可忽視的感染途徑是將含有裂頭蚴的生青蛙肉或是蛇肉用于治療皮膚潰瘍或是眼部炎癥［5，6］。裂頭蚴進(jìn)入人體之后，能夠寄生在各種組織，例如眼睛、皮下組織、內(nèi)臟器官和腦部。裂頭蚴感染能夠?qū)е聡?yán)重的眼部疾病、組織損傷和腦部功能紊亂。

annexin是依賴(lài)鈣離子的磷脂結(jié)合蛋白，具有多種生物學(xué)功能，25年前就已被發(fā)現(xiàn)，第一個(gè)被分離和純化是人annexinA7［7］。annexin分為A家族（在脊椎動(dòng)物中）、B家族（無(wú)脊椎動(dòng)物）、C家族（在真菌類(lèi)和一些單細(xì)胞真核生物）、D類(lèi)家族（在植物中）和家族E（在原生生物中）［8］。annexin獨(dú)特的核心區(qū)域是4個(gè)相似的重復(fù)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)重復(fù)結(jié)構(gòu)域由約70個(gè)氨基酸組成，并且含有一個(gè)結(jié)合鈣離子特征性的“typeⅡ”或“typeⅢ”結(jié)構(gòu)。annexin能夠與各種參與細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和控制生長(zhǎng)的細(xì)胞膜成分相互作用。annexin還能夠作為非典型的鈣離子通道。許多研究顯示annexin在寄生蟲(chóng)中參與了寄生蟲(chóng)與宿主之間的相互作用，并參與宿主的免疫調(diào)節(jié)［9］。豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴的annexinB1被證實(shí)在體外能夠抑制磷脂酶A2的活性，并且是annexins中的一個(gè)分泌成分［10］。在華支睪吸蟲(chóng)中，annexinB30被證實(shí)是華支睪吸蟲(chóng)的分泌排泄抗原成分之一，能夠在鈣離子存在的情況下結(jié)合磷脂和人纖溶酶原［11］。牛裂體吸蟲(chóng)的annexin在體外具有溶解纖維蛋白和抗凝的特性，可能對(duì)寄生蟲(chóng)在血液中存活發(fā)揮重要作用［12］。曼氏裂體吸蟲(chóng)的annexin 2被認(rèn)為是一個(gè)潛在的疫苗候選分子［13］。在麝貓后睪吸蟲(chóng)中，annexin定位在寄生蟲(chóng)的體表，并且可能在免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮了作用［14］。

在本次研究中，我們鑒定了來(lái)源于曼氏迭宮絳蟲(chóng)的SmannexinB8基因，并且進(jìn)行了關(guān)于潛在生物化學(xué)特性的生物信息學(xué)分析。我們的結(jié)果表明SmannexinB8可能是一個(gè)分泌蛋白，能夠抑制磷脂酶A2的活性，在寄生蟲(chóng)和宿主相互作用中發(fā)揮了非常重要的作用。

1　材料與方法

1.1SmannexinB8核酸序列分析

從狗腸中分離的成蟲(chóng)用來(lái)構(gòu)建曼氏迭宮絳蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)，得到的EST標(biāo)簽由上海聯(lián)眾基因科技研究院完成測(cè)序，編碼SmannexinB8的cDNA序列從該文庫(kù)調(diào)取，其開(kāi)放閱讀框是通過(guò)利用（http：// www.expasy.org/）中的ORF finder tool進(jìn)行查找。

1.2SmannexinB8氨基酸序列分析

SmannexinB8蛋白的物理化學(xué)參數(shù)是通過(guò)ExPASy ProtParam獲取。并利用ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行該蛋白的信號(hào)肽和跨膜螺旋的預(yù)測(cè)。SmannexinB8的保守功能域是通過(guò)NCBI/BLAST Home進(jìn)行檢測(cè)。利用ExPASy PredictProtein進(jìn)行SmannexinB8分子功能和生物學(xué)過(guò)程本體分析，預(yù)測(cè)該蛋白具有的潛在分子生物學(xué)功能。

1.3同源性和分子進(jìn)化樹(shù)分析

為了進(jìn)行同源性和分子進(jìn)化樹(shù)分析，我們通過(guò)NCBI中獲取了不同物種的annexin序列，利用生物信息學(xué)分析軟件Vector NTI suit 8.0和TreeView進(jìn)行結(jié)果分析。

1.4SmannexinB8結(jié)構(gòu)模型構(gòu)建

SmannexinB8三維空間是利用編碼蛋白的氨基酸通過(guò)SWISS-MODEL進(jìn)行預(yù)測(cè)和SPDBV 4.10進(jìn)行結(jié)果分析。

1.5SmannexinB8基因克隆

SmannexinB8的開(kāi)放閱讀框以曼氏迭宮絳蟲(chóng)文庫(kù)中的cDNA作為模板利用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，特異性的PCR引物是通過(guò)Primer Premier 5.0 and PCRDESIGN軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)的，上游和下游引物分別是5′-TAAGAGCTCATGCTGCGTTACAG TCG-3′；5′-TTCTCGAGTTAGCACCCAATTAGG GC-3′。擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下：94℃變性45 s，55℃退火45 s、72℃延伸1 min，共35循環(huán)，72℃穩(wěn)定10 min。PCR產(chǎn)物純化后，利用相同的限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切并與預(yù)先酶切好的原核表達(dá)載體pET-28a（+）進(jìn)行連接。重組的質(zhì)粒通過(guò)DNA測(cè)序驗(yàn)證，然后轉(zhuǎn)入到大腸埃希菌DH5α中。

2　結(jié)果

2.1核酸序列分析

ORF finder結(jié)果顯示SmannexinB8核酸序列是全長(zhǎng)序列，由1 044個(gè)堿基對(duì)組成，見(jiàn)圖1。

圖1　曼氏迭宮絳蟲(chóng)SmannexinB8的開(kāi)放閱讀框Figure 1The open reading frame of SmannexinB8

2.2編碼氨基酸的特征

SmannexinB8蛋白由347個(gè)氨基酸組成，如圖2所示。氨基酸組成部分主要為L(zhǎng)eu，Ala，Glu和Asp，分別占了12.4％，10.4％，8.9％and 7.5％。預(yù)測(cè)該蛋白的理論分子量是38.7 kDa，理論pI值是4.95。該蛋白在哺乳動(dòng)物中的半衰期是30 h，在酵母和大腸埃希桿菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。該蛋白是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白，其不穩(wěn)定系數(shù)是31.15。預(yù)測(cè)的C值、S值和Y值都低于0.5，這提示了該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽，如圖3A所示。跨膜螺旋分析結(jié)果顯示了該蛋白不是一個(gè)跨膜蛋白，可能是一個(gè)可溶性的蛋白分子，如圖3B所示。

圖2　曼氏迭宮絳蟲(chóng)SmannexinB8的氨基酸組成Figure 2Amino acid composition of SmannexinB8

2.3同源性和進(jìn)化樹(shù)分析

通過(guò)annexin的多序列比對(duì)，結(jié)果如圖4顯示，SmannexinB8編碼氨基酸序列與多房棘球絳蟲(chóng)、口膜殼絳蟲(chóng)、細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)和人的annexin基因的同源性分別是68％，67％，65％，46％and 40％。該蛋白是由4個(gè)annexin重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成，同源功能域包含了一個(gè)特殊的typeⅢ（“GxGTDE”結(jié)構(gòu)）鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，這個(gè)結(jié)構(gòu)能夠增強(qiáng)鈣離子和磷脂之間的親和力。此外，K/H/ RGD結(jié)構(gòu)分別在重復(fù)結(jié)構(gòu)域Ⅱ和Ⅲ中。IRI結(jié)構(gòu)與人、豬帶絳蟲(chóng)和糞類(lèi)圓線(xiàn)蟲(chóng)中的重復(fù)結(jié)構(gòu)域IV相互識(shí)別，IRI結(jié)構(gòu)具有肌動(dòng)蛋白結(jié)合功能，而在SmannexinB8中編碼氨基酸發(fā)生了變化。

圖3　曼氏迭宮絳蟲(chóng)Smannexin B8的功能區(qū)域分析Figure 3Analysis of Smannexin B8 functional domains

SmannexinB8的分子進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示SmannexinB8與絳蟲(chóng)屬（多房棘球絳蟲(chóng)和口膜殼絳蟲(chóng)）親源性更近，而與其他例如吸蟲(chóng)屬和哺乳動(dòng)物親源性較遠(yuǎn)，見(jiàn)圖5。

2.4SmannexinB8結(jié)構(gòu)模型

SmannexinB8的保守功能區(qū)由4個(gè)annexin重復(fù)結(jié)構(gòu)域組成（圖6A）。該結(jié)構(gòu)域的組成分別是26（aa）-88（aa）、100（aa）-171（aa）、204（aa）-268（aa）和280（aa）-344（aa）。通過(guò)SWISS-MODEL對(duì)SmannexinB8的三維空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖6B所示。其中，4個(gè)結(jié)構(gòu)域分別由4種不同原子方式顯示出來(lái)。

2.5分子功能和生物過(guò)程的本體論分析

分子功能分析顯示SmannexinB8能夠與鈣離子依賴(lài)性磷脂、鈣離子、磷脂酰絲氨酸和真核細(xì)胞表面等相結(jié)合，該蛋白還具有結(jié)構(gòu)分子活性和抑制磷脂酶A2的功能。同時(shí)，SmannexinB8在抗凋亡、細(xì)胞形狀調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡、細(xì)胞之間黏附和炎癥反應(yīng)的生物過(guò)程中都發(fā)揮重要的作用。

2.6SmannexinB8基因的分子克隆

SmannexinB8全長(zhǎng)基因經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后得到，然后克隆到原核表達(dá)載體pET-28a（+）中，重組質(zhì)粒通過(guò)DNA測(cè)序和限制性?xún)?nèi)切酶Sac1和Xhol1酶切鑒定證實(shí)，雙酶切得到的條帶分別與PCR產(chǎn)物和pET-28a（+）質(zhì)粒的條帶相一致（圖7）。

3　討論

annexin是一個(gè)存在多種真核細(xì)胞中并參與鈣離子和膜結(jié)合蛋白表達(dá)的家族［15］。該家族成員具有各種功能，如參與細(xì)胞的活動(dòng)、鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)研究中，SmannexinB8是第一次被鑒別和進(jìn)行生物信息學(xué)分析。SmannexinB8的結(jié)構(gòu)和潛在功能特征也進(jìn)行了描述。在我們實(shí)驗(yàn)研究中，SmannexinB8的全長(zhǎng)序列從曼氏迭宮絳蟲(chóng)的成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中分離得到（圖1），由347氨基酸組成。雖然annexins是胞內(nèi)蛋白，不僅能定位在細(xì)胞質(zhì)中，也能與細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合［16］。盡管SmannexinB8缺乏分泌信號(hào)肽且不屬于膜蛋白，但是許多研究證實(shí)該蛋白存在于細(xì)胞外［17-20］。在豬帶絳蟲(chóng)中，annexinB1通過(guò)蛋白印跡分析在囊尾蚴的囊液中和囊尾蚴感染的豬血清中檢測(cè)到［10］。這結(jié)果提示annexinB1屬于annexin家族中的分泌蛋白。annexinB30也分別通過(guò)LC-MS/MS［21］和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)是華支睪吸蟲(chóng)的分泌排泄抗原之一［11］。另外，進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，SmannexinB8與多房棘球絳蟲(chóng)和華支睪吸蟲(chóng)親源性也較近。綜合以上結(jié)果，SmannexinB8可能是曼氏迭宮絳蟲(chóng)分泌排泄抗原成分之一。蟲(chóng)體釋放的分泌排泄抗原能夠?qū)е虏±碜兓蛥⑴c逃避宿主免疫清除和寄生蟲(chóng)吸收營(yíng)養(yǎng)［22-23］。因此，SmannexinB8可能在寄生蟲(chóng)存活和寄生蟲(chóng)與宿主相互作用中是一個(gè)至關(guān)重要的分子。

圖4　曼氏迭宮絳蟲(chóng)annexinB8與其他物種annexin的序列比對(duì)Figure 4Alignment of SmannexinB8 amino acid sequence with annexin from other species

圖5　細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)annexinB8的分子進(jìn)化樹(shù)Figure 5Molecular evolution tree of the SmannexinB8

圖6　曼氏迭宮絳蟲(chóng)annexinB8典型的4個(gè)重復(fù)序列分析Figure 6Analysis of 4 repeats of SmannexinB8

圖7　SmannexinB8基因的原核表達(dá)載體構(gòu)建Figure 7Cloning of gene encoding Smannexin B8

annexin多序列比對(duì)結(jié)果顯示SmannexinB8的編碼氨基酸序列與人annexin序列相似性只有40％。由于SmannexinB8與人annexin的同源性相對(duì)較低，所以SmannexinB8有望成為控制人類(lèi)裂頭蚴病的有價(jià)值的疫苗開(kāi)發(fā)靶點(diǎn)。該蛋白同源功能域中含有“GxGTDE”結(jié)構(gòu)，說(shuō)明SmannexinB8擁有特征性的typeⅢ的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)。該位點(diǎn)能夠使其與鈣離子和磷脂高親和力結(jié)合［8，16］。由于結(jié)合鈣離子的KGD結(jié)構(gòu)位于repeatⅡ和repeatⅢ之間，SmannexinB8可能擁有在鈣離子存在時(shí)結(jié)合磷脂的特性。此外，KGD結(jié)構(gòu)在膜相互作用和受體靶標(biāo)中的作用闡明了annexin的功能［24］。然而，與人annexin相比，IRI肌動(dòng)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)被其他氨基酸代替。有些annexin在體外直接與聚合肌動(dòng)蛋白相互作用，從而參與調(diào)節(jié)、穩(wěn)定和介導(dǎo)細(xì)胞膜肌動(dòng)蛋白［25］。事實(shí)上，也有報(bào)道提示了IRI結(jié)構(gòu)存在與否都不影響annexin結(jié)合肌動(dòng)蛋白［26］。此外，該蛋白的保守功能域和它的三維空間結(jié)構(gòu)分析顯示SmannexinB8保持它的結(jié)構(gòu)完整性。生物過(guò)程和分子功能本體論分析提示SmannexinB8參與多種重要生物功能，例如鈣離子依賴(lài)的磷脂相互作用、抗凋亡、細(xì)胞增生和炎癥調(diào)節(jié)。SmannexinB8還參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡和抑制磷脂酶A2的活性，磷脂酶A2是脂質(zhì)炎癥調(diào)節(jié)中的限速步驟。而控制磷脂酶A2的活性是調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程的重要環(huán)節(jié)［27］。在豬帶絳蟲(chóng)研究中發(fā)現(xiàn)，annexinB1通過(guò)抑制哺乳動(dòng)物的磷脂酶A2來(lái)下調(diào)宿主的炎癥反應(yīng)［10］。此外，還有研究報(bào)道annexin也可能是通過(guò)釋放IL-10介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［28］。這些都提示了SmannexinB8可能通過(guò)抑制磷脂酶A2活性和介導(dǎo)IL-10釋放來(lái)參與免疫反應(yīng)。在生物學(xué)過(guò)程的本體論分析中，SmannexinB8在抗凋亡中發(fā)揮重要作用。凋亡是生理細(xì)胞死亡的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中，細(xì)胞可以在沒(méi)有誘發(fā)免疫反應(yīng)的情況下，從體內(nèi)清除［27］。McKanna的研究發(fā)現(xiàn)在經(jīng)歷凋亡的乳腺導(dǎo)管的肺泡細(xì)胞中，annexin1的表達(dá)中顯著增加［29］。許多的研究也證實(shí)了在一些細(xì)胞中，annexin1可能通過(guò)發(fā)揮鈣離子流的作用來(lái)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡［30］。此外，SmannexinB8的理論分子量和pI值分別是38.7 kDa和4.95。該蛋白是屬于穩(wěn)定的蛋白，并且原核表達(dá)質(zhì)粒已經(jīng)構(gòu)建成功。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。

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Sequence bioinformatics analysis and gene cloning of annexinB8 from Spirometra mansoni

LIANG Pei1，LV Gang1，ZHOU Xiaojun2，CHEN Xinxin1，CHEN Xiaojing1，F(xiàn)U Ruijia1★
（1.Department of Pathogen Biology，Hainan Medical College，Haikou，Hainan，China，571199；2.Clinical Laboratory，Hainan Province People's Hospital，Haikou，Hainan，China，570311）

ObjectiveTo provide information and solid materials for further research on annexinB8 of Spirometra mansoni（SmannexinB8）which may participate in mediating host immune response.Methods The open reading frame of SmannexinB8 was found with ORF finder tool in NCBI website.ExPASy website was used to predict the physical and chemical parameters of protein，signal peptide，transmembrane helices and potential molecular and biological functions.The conserved domains of the protein were detected by NCBI/BLAST Home.In order to analyze the homology and phylogenetic tree，sequences of annexins from various species were obtained from NCBI website，and the results were analyzed by Vector NTI suit 8.0 and TreeView software.The three-dimensional structure of SmannexinB8 was predicted by SWISS-MODEL and was analyzed by SPDBV 4.10.Moreover，the gene was amplified and cloned into a prokaryotic expression vector pET-28a（+）.ResultsSmannexinB8 was full-length gene and encoded 347 amino acid residues. The protein was composed of four annexin repeats without signal peptide and a stably soluble molecule.Itwas a conservative annexin in three-dimensional structure.SmannexinB8 was homologous to annexins from Echinococcus multilocularis，Hymenolepis microstoma，Echinococcus granulosus，Clonorchis sinensis and Homo sapiens with 68％，67％，65％，46％and 40％identities，respectively.SmannexinB8 clustered with the annexins from the tapeworm genus，but not with other species like trematode and mammal animals.Conclusions SmannexinB8 might have a multitude of functions：inhibition of phospholipase A2，promoting fusion，mediating immune response and formation of ion channel.SmannexinB8 might play a critical role in the host immune response.

Spirometra mansoni；AnnexinB8；Bioinformatics analysis；Multi-functions

國(guó)家自然科學(xué)基金課題（81260254）；海南省自然科學(xué)基金課題（814289）

1.海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，海南，?？?71199 2.海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南，?？?70311

符瑞佳，E-mail：18171809@qq.com