王怡心1 陳雄豪2★ 林惠玲1 蔣英1

Xpert MTB/RIF技術(shù)在基層實驗室結(jié)核病診斷中的應(yīng)用研究

王怡心1 陳雄豪2★ 林惠玲1 蔣英1

目的評估結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（Xpert MTB/ RIF）在基層實驗室結(jié)核病診斷中的可行性與準確性。方法對1 042例來自區(qū)級結(jié)核病防治單位門診初診者的痰液樣品，分別進行涂片鏡檢、固體培養(yǎng)、傳統(tǒng)比例法藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測，分析比較Xpert MTB/RIF法和傳統(tǒng)方法檢測痰標本中的Mtb及其耐藥性的敏感度、特異度及檢測耗時。結(jié)果以固體培養(yǎng)試驗結(jié)果作為金標準，Xpert Mtb/RIF方法檢測痰標本Mtb的敏感度和特異度分別93.7％（655/699）和87.5％（300/343）。以傳統(tǒng)比例法藥敏試驗結(jié)果為金標準，Xpert Mtb/RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度和特異度分別為86.8％（79/91）和95.3％（531/557）。Xpert MTB/RIF系統(tǒng)平均檢測耗時為2 h。結(jié)論Xpert Mtb/RIF檢測操作簡單、快速，檢測敏感度高于涂片鏡檢法，與固體培養(yǎng)法有極好的一致性，同時該方法可以診斷患者是否對利福平耐藥，在我國縣（區(qū)）級實驗室具有非常好的應(yīng)用前景。

結(jié)核分支桿菌；利福平；Gene Xpert檢測；敏感度與特異度

在當今社會結(jié)核病仍然是一個重要的公共衛(wèi)生問題，據(jù)報道世界上約有三分之一的人口感染結(jié)核桿菌，其中每年新發(fā)病人約有900萬，死亡人數(shù)高達300萬［1］。隨著耐多藥的病例日益增多，這將造成結(jié)核病更加瘋狂的流行。而在我國結(jié)核疫情十分嚴峻，具有感染人數(shù)多、死亡人數(shù)多、耐藥人數(shù)多和傳染性肺結(jié)核患病率高的特點。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）強調(diào)遏制結(jié)核病的主要方法是普及高效和以人為本的檢測診斷技術(shù)，而快速檢測和可靠的耐藥性測試是先決條件［2］。然而，世界的許多地區(qū)，結(jié)核病診斷仍然依賴于不敏感、缺乏標準化的抗酸桿菌染色法和耗時很長且要求標本含有存活的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）才能培養(yǎng)。至于藥敏試驗，目前WHO已經(jīng)推薦了常用的固體和液體培養(yǎng)基的一線和二線抗結(jié)核藥物藥敏試驗方法所需要的藥物臨界濃度和臨界比例［3］，但固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)方法分別需要4 w和2 w才能報告藥敏結(jié)果?；谏鲜鎏岬降默F(xiàn)有實驗室診斷方法的局限性，隨著結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的分子檢測方法即結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)（xpert mycobacterium tuberculosis/rifampin，Xpert MTB/ RIF）已經(jīng)受到廣泛關(guān)注。目前WHO十分認可Xpert MTB/RIF，并認為“這種檢測方法可能對結(jié)核病的治療和控制帶來革命性變化，是全球結(jié)核病診斷和治療方面的一個重要里程碑”。在經(jīng)過了18個月的嚴格評估，2010年12月WHO正式推薦使用Xpert MTB/RIF技術(shù)作為一種全新的結(jié)核病快速檢測新方法用于結(jié)核病及利福平耐藥的檢測。為了評估該技術(shù)在基層實驗室結(jié)核病診斷中的可行性與準確性，本研究擬對1 042例疑似結(jié)核病患者的痰標本分別采用傳統(tǒng)方法和Xpert MTB/ RIF法進行檢測，通過比對檢測的敏感度、特異度及檢測耗時評價Xpert MTB/RIF法在基層實驗室的應(yīng)用前景。

1　方法

1.1實驗對象

1 042份痰標本來自2012年10月至2014年12月在深圳市6個區(qū)級慢性病防治院就診的疑似結(jié)核病患者。

1.2研究方法

所有標本分別進行涂片鏡檢、羅氏固體培養(yǎng)、比例法藥敏試驗和Xpert MTB/RIF檢測。

1.2.1抗酸染色

按照中國結(jié)核病防治規(guī)劃《痰涂片鏡榆標準化操作及質(zhì)量保證手冊》中要求進行操作。

1.2.2分離培養(yǎng)及藥敏試驗

采用4％氫氧化鈉處理法，用無菌操作的方法將標本接種于改良羅氏培養(yǎng)基的斜面上，37℃分別培養(yǎng)3 d和7 d后各觀察1次。此后，每周觀察1次生長情況并記錄，培養(yǎng)至陽性結(jié)果出現(xiàn)，或60天后無生長判斷為陰性結(jié)果。一旦培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌落，即進行抗酸染色涂片確認是抗酸桿菌，然后進行生化實驗菌種鑒定及藥敏，培養(yǎng)陽性標本參照《結(jié)核病細菌學(xué)檢驗規(guī)程》［4］。

1.2.3Xpert MTB/RIF檢測

將標本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液常規(guī)按1∶2比例混合（若痰中含膿球則為1∶3），震蕩，室溫靜置15 min，再將混合液轉(zhuǎn)移至一次性多室塑料反應(yīng)盒中，置于Gene Xpert檢測系統(tǒng)（美國Cepheid公司）進行全自動檢測，約2 h即可在檢測軟件窗口直接讀取結(jié)果。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0對Xpert MTB/RIF及涂片法與固體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果進行一致性檢驗（Kappa檢驗），K＜0.4為一致性差，在0.40～0.75之間為一致性好，K≥0.75為一致性極好。涂片法與Xpert MTB/RIF的敏感度、特異度比較及Xpert MTB/RIF與比例法檢測利福平耐藥率的比較使用χ2檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2　結(jié)果

2.1Xpert MTB/RIF對痰標本Mtb的檢測結(jié)果

表1中顯示，以固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測1 042例樣本中Mtb的敏感度為93.7％（655/699）、特異度為87.5％（300/343），總體符合率為91.7％；涂片法檢測結(jié)果的敏感度為84.3％（589/699）、特異度為94.5％（324/343），總體符合率為87.6％。對Xpert MTB/RIF和固體培養(yǎng)進行Kappa檢驗，K=0.811，兩者具有極好的一致性。對涂片法和固體培養(yǎng)進行Kappa檢驗，K= 0.737，兩者具有好的一致性。但以固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，涂片法與Xpert MTB/RIF的敏感度、特異度比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（χ2值分別為31.787與10.213，相對應(yīng)的P值分別為0.000與0.001），Xpert MTB/RIF法敏感度優(yōu)于涂片法，涂片度的特異性優(yōu)于Xpert MTB/RIF法。

表1　以固體培養(yǎng)試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測Mtb分析Table 1Mtb analysis by Xpert MTB/RIF based on the solid culture result

2.2Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥分析

表2結(jié)果中，以比例法藥敏結(jié)果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測648例利福平耐藥結(jié)果的敏感度為86.8％（79/91）、特異度為95.3％（531/557），Xpert MTB/RIF與比例法對利福平耐藥性的檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異，χ2值為1.178，P=0.278＞0.05。

表2　以比例法藥敏試驗金標準，Xpert MTB/RIF檢測對利福平耐藥分析Table 2Rifampin resistance analysis of Xpert MTB/RIF based on the conventional drug susceptibility test result

2.3檢測時間

本次實驗全部完成的時間僅用2 h，比目前大多數(shù)的肺結(jié)核實驗室診斷技術(shù)有很大的時間優(yōu)勢。

3　討論

Gene Xpert實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)采用的是巢式實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)體外診斷方法，它整合了傳統(tǒng)PCR檢測所需的樣品的制備，核酸的提取、擴增，目標序列的檢測等全部步驟。其采用了獨立的一次性試劑盒，并由系統(tǒng)自動完成，相比傳統(tǒng)的PCR方法，具有操作簡便、生物安全性高、檢測過程不易受干擾等優(yōu)點。Xpert MTB/RIF檢測試劑盒能檢測樣本中的結(jié)核桿菌和與利福平耐藥相關(guān)的rpoB基因，能對耐多藥患者進行初篩，此外它有很高的敏感性和特異性，檢驗周期也非常短。正是基于上述的巨大優(yōu)勢，WHO將這一檢測方法納入其工作規(guī)劃的建議和指導(dǎo)，并且發(fā)布各國的推薦和執(zhí)行手冊，推薦將此新技術(shù)合并到各國的結(jié)核病防治計劃，并強烈推薦此方法應(yīng)作為低中收入國家對耐藥性結(jié)核病和結(jié)核病/艾滋病聯(lián)合感染的首選檢測方法。因痰液行抗酸染色陽性率較低，且結(jié)核病痰樣本結(jié)核菌數(shù)目需＞5 000條/mL才能得到陽性結(jié)果［5］。涂片法亦有其它缺點，如抗酸桿菌包括結(jié)核分枝桿菌及非結(jié)核分枝桿菌，即使抗酸染色陽性亦不能說明是否為結(jié)核分枝桿菌感染。本次實驗中的Xpert MTB/RIF法對結(jié)核桿菌檢測的敏感度為93.7％，明顯優(yōu)于涂片法的84.3％，與固體培養(yǎng)法進行比較，兩者具有極好的一致性，同時在110例涂片法陰性而固體培養(yǎng)法為陽性樣品中，Xpert MTB/RIF檢測結(jié)果陽性80例，陰性30例，由此可見該方法可作為抗酸染色鏡檢的后續(xù)檢測手段［6-9］。

本實驗在區(qū)級結(jié)核病防治機構(gòu)采用臨床就診的疑似結(jié)核病患者的痰標本，通過Xpert MTB/ RIF檢測其Mtb及利福平耐藥性的敏感度、特異度及檢測耗時。結(jié)果顯示，Mtb的敏感度到達93.7％、特異度為87.5％，其中，敏感度與2010年在南美洲、非洲和亞洲多個國家級結(jié)核病實驗室共同對1 843例患者進行Xpert MTB/RIF檢測報道的結(jié)果96.0％相近，而特異度略低于國外報道的98.6％［10］，特異度略低于國外相關(guān)報道，可能是由于我國是以傳統(tǒng)固體培養(yǎng)試驗作為金標準，而國外多以敏感性較高的液體培養(yǎng)作為金標準［11］的原因所導(dǎo)致。同時近年來國內(nèi)有研究發(fā)現(xiàn)，針對不同的檢測標本Gene Xpert的敏感度和特異度顯示出不同的差異。李輝等［12］提出Xpert MTB/RIF檢測Mtb對于涂片陽性標本檢測的敏感度高，對于臨床診斷為肺結(jié)核標本的敏感度較低，而特異度則相反，這說明用Xpert MTB/RIF檢測方法在檢測不同標本時，敏感度與特異度之間需要需求平衡，但對于不同標本Gene Xpert都顯示出很高的特異度。

目前，利福平耐藥作為耐多藥的主要參考標準，以比例法藥敏試驗為金標準，Xpert MTB/RIF檢測Mtb對利福平耐藥性檢測的敏感度和特異度分別為86.8％和95.3％，敏感度也略低于國外相關(guān)報道的97.6％［10］，張治國等［11］提出將比例法藥敏試驗和差異菌株測序結(jié)果聯(lián)合作為金標準，其敏感度和特異度都能得到提升。耐利福平分支桿菌的耐藥基因雖然多集中在81 bp的核心突變區(qū)，但在我國不同的地域人群中利福平耐藥菌株的rpoB基因的突變頻率不盡相同［13］，但Gene Xpert是通過檢測rpoB基因片段核心突變區(qū)來診斷耐利福平結(jié)核病。有研究通過比較我國不同地域標本，結(jié)果顯示Mtb對利福平耐藥具有較高的敏感度和特異度以及與傳統(tǒng)金標準藥敏試驗較高的一致性［12］。這個就進一步顯示出Xpert MTB/RIF檢測方法在我國具有較強的實用性。

Xpert MTB/RIF的檢測平均耗時為2小時，而痰涂片要1天，液體培養(yǎng)需要半個月、固體培養(yǎng)要超過1個月才能得出結(jié)果，而對利福平的藥敏檢則需要超過2個月的時間。這其中時間成本的差別是顯而易見的。

Xpert MTB/RIF也存在某些自身的問題及局限性，如本次實驗就有51例無利福平耐藥結(jié)果。這可能除了跟Gene Xpert儀器的注射器和探測信號有關(guān)，更大程度可能是與留取的標本質(zhì)量有關(guān)，如標本不足1mL、標本為唾液、標本為帶有血液或食物殘渣的不合格樣本［14］，這些都有可能導(dǎo)致測試失敗。其它不足之處還有：Xpert MTB/RIF在兒童結(jié)核病診斷方面的實驗結(jié)果并不樂觀［15-16］；該技術(shù)不能檢測異煙肼等耐藥情況；對肺外標本有關(guān)的檢測證據(jù)有限；試劑盒成本較高等。而且到目前為止，全球尚未發(fā)表有關(guān)該系統(tǒng)對結(jié)核病傳播控制的效果研究報告，而且絕大部分研究都是在參比實驗室完成，缺乏在門診或縣區(qū)級實驗室使用效果的詳細數(shù)據(jù)［17］。但是Xpert MTB/RIF作為一種快速、直接可靠、高敏感度、特異度地檢測出結(jié)核病患者及是否對利福平耐藥的新診斷技術(shù)，可以幫助臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)越來越多的常規(guī)檢測不易發(fā)現(xiàn)的結(jié)核病人，以及比常規(guī)方法預(yù)先發(fā)現(xiàn)耐多藥結(jié)核病。而且目前Gene Xpert儀器除了用于普通結(jié)核病診斷外，也已經(jīng)開始用于檢測白血病、腸病毒和鏈球菌等多種病原微生物，但是由于設(shè)備價格和使用成本比較高，短期而言要大范圍推廣會有一定的困難。從2013年起中國全球基金給全國幾十家基層結(jié)核病防治機構(gòu)陸續(xù)配發(fā)了Gene Xpert檢測系統(tǒng)并在全國范圍內(nèi)舉行了多期培訓(xùn)班，這就大大促進了Gene Xpert檢測系統(tǒng)的推廣和使用。WHO建議加快Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)作為一種全新的結(jié)核病快速診斷新工具的使用。由于該儀器僅需要兩個獨立區(qū)域，這種較低的硬件設(shè)施要求使其未來可以在更多的縣、區(qū)級基層實驗室開展，有助于結(jié)核病患者較早的得到準確的診斷、充分的治療和患者管理［18］。本實驗也在某種程度上再次證明該方法在我國基層實驗室對于結(jié)核病診斷及利福平耐藥患者的篩查方面具有一定的意義和前景。

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Application research of Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosisin in the primary laboratory

WANG Yixin1，CHEN Xionghao2★，LIN Huiling1，JIANG Ying1
（1.Department of Laboratory Medicine，F(xiàn)utian District Hospital for Prevention and Treatment of Chronic Diseases，Shenzhen，Guangdong，China，518048；2.Department of Laboratory Medicine，F(xiàn)utian District Maternal and Child Health Hospital，Shenzhen，Guangdong，China，518048）

ObjectiveTo investigate the feasibility and accuracy of Xpert MTB/RIF assay in the diagnosis of tuberculosis in primary laboratory.Methods1 042 sputum samples from patients with clinically suspected tuberculosis from clinics in Shenzhen were collected.And the sensitivity，specificity and test time of different detection methods，including smear test，solid culture，traditional proportion method drug susceptibility test，and Xpert MTB/RIF test，in the detection rate of mycobacterium tuberculosis（MTB）and rifampicin resistance，were analyzed.ResultsCompared with the results of the solid culture test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for MTB respectively were 93.7％（655/699）and 87.5％（300/343）.Compared with the results of traditional proportion method drug susceptibility test，the sensitivity and specificity of the Xpert MTB/RIF for in the detection rate of rifampicin resistance respectively were 86.8％（79/91）and 95.3％（531/557），and the mean of test time of Xpert MTB/RIF was 2.1 hours（range，1.8-2.6 hours）.Conclusion

Mycobacterium tuberculosis；Rifampin；Gene Xpert test；Sensitivity and specificity

·綜述·

1.深圳市福田區(qū)慢性病防治院檢驗科，廣東，深圳518048 2.深圳市福田區(qū)婦幼保健院檢驗科，廣東，深圳518048

陳雄豪，E-mail：raky1111@163.com

Compared with other test methods，Xpert MTB/RIF test significantly improved the diagnositic sensitivity and specificity for MTB.Xpert MTB/RIF test can be used to detect rifampicin resistance.And Xpert MTB/RIF test will provide a specific method for the early diagnosis of tuberculosis.