符瑞佳 呂剛 尹飛飛 梁培★

·論著·

細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白的生物信息學分析

符瑞佳 呂剛 尹飛飛 梁培★

目的應用生物信息學技術(shù)對細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus）14-3-3zeta蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進行預測和分析，為進一步的實驗研究提供依據(jù)。方法利用美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和瑞士生物信息學研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（ExPASY，http：// expasy.org/）提供的各種有關(guān)基因和蛋白序列、結(jié)構(gòu)信息分析的工具，并結(jié)合其它生物信息學分析軟件，對該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進行預測和分析。結(jié)果該基因全長為771 bp，編碼256個氨基酸，其編碼的蛋白相對分子量理論預測值和等電點分別是29.4 kDa和5.04。預測該蛋白無信號肽和跨膜區(qū)，二級結(jié)構(gòu)含8個α-螺旋和12個β-折疊股，氨基酸序列中有9個潛在抗原表位。結(jié)論初步認識了細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白的基本特征，為深入研究該蛋白的生物學功能奠定了基礎(chǔ)。

細粒棘球絳蟲；14-3-3zeta蛋白；生物信息學；結(jié)構(gòu)；功能

細粒棘球絳蟲（Echinococcus granulosus，Eg）是一種重要的人獸共患的寄生蟲，其成蟲寄生于犬科食肉動物，幼蟲能夠寄生于人及多種食草動物，引起一種嚴重的囊型棘球蚴病（Cystic echinococcosis），又稱為囊型包蟲病。在人與動物之間互相傳播，人因誤食蟲卵而感染，其包蟲囊腫在肝臟內(nèi)最為多見，偶爾侵襲肺部、腦部、骨骼等其它器官［1-2］。在我國西部和北部廣大的農(nóng)牧地區(qū)，生活水平落后，群眾防范意識較差，導致該病的感染十分嚴重［3］。同時，近年來全國各地養(yǎng)家犬數(shù)量的增加，可能會導致棘球蚴病的向多地蔓延，嚴重影響了人民的生命健康，且對當?shù)氐男竽翗I(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。

隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展，許多國內(nèi)外的學者近年來在棘球蚴病的預防和治療方面取得了一定的進展，但依然沒有達到理想的效果［4-7］。因此，有必要尋找新的候選基因，并對其生物學相關(guān)功能進行鑒定，為棘球蚴病的防治奠定基礎(chǔ)。本研究選取了細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白，采用生物信息學技術(shù)對其結(jié)構(gòu)和功能進行預測和分析，為進一步的實驗研究提供議論依據(jù)，判定該蛋白在細粒棘球蚴病的防治和診斷過程中是否存在一定的價值。

1　材料

細粒棘球絳蟲成蟲全長cDNA質(zhì)粒文庫由上海聯(lián)合基因公司構(gòu)建，大規(guī)模測序得到多個表達序列標簽（EST）。編碼細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的核酸序列從該文庫中獲取，GenBank中的登錄號為EUB61917.7。

2　方法

通過NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）BLASTx（http：//expasy.org/）程序，將基因序列編碼的氨基酸序列與GeneBank中的蛋白質(zhì)序列進行對比，推測該基因的功能，判斷是否全長基因。利用ORF Finder查找其完整的編碼序列，然后再用Translation程序推導并輸出其氨基酸序列。編碼的氨基酸序列與其他物種的序列利用Vector NTI suite 8.0進行多序列比對和利用Tree-View software分析進化樹。通過蛋白分析系統(tǒng)Expasy（http：//www.expasy.org/）所提供的蛋白組學和序列在線分析工具，如Protparam進行該蛋白理化性質(zhì)的預測；MotifScan對理論蛋白質(zhì)進行功能位點預測；TargetP分析亞細胞定位序列；PredictProtein預測氨基酸序列的跨膜區(qū)和拓撲結(jié)構(gòu)以及二級結(jié)構(gòu)、分子的親水性、溶液中的分子形態(tài)等；BepiPred進行B細胞表位預測；Swiss-modle分析蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

3　結(jié)果

3.1基因的識別和鑒定

利用Blastx對該基因進行核苷酸水平的相似性分析，發(fā)現(xiàn)了文庫中有一條相似度為100％的序列，屬于細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白序列。該基因全長為771 bp，開放閱讀框為35 bp～805 bp，編碼256個氨基酸，見圖1。

圖1　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的ORF編碼及氨基酸序列Figure 1ORF sequence of Eg14-3-3zeta and amino acid sequence

細粒棘球絳蟲14-3-3zeta功能域的分析結(jié)果，顯示有多個多肽結(jié)合位點和多聚體結(jié)合位點存在，見圖2。

圖2　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta功能域分析Figure 2Analysis of functional domain of Eg14-3-3zeta

3.2蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

預測該蛋白質(zhì)的理論等電點（PI）為5.04，分子量為29.4 kDa。當二硫鍵全部打開的時候，280 nm處摩爾消光系數(shù)為34 380 U·M-1·cm-1，0.1％濃度的Abs為1.168；當二硫鍵全部為二硫鍵時，280 nm處摩爾消光系數(shù)為34 755 U·M-1·cm-1，0.1％濃度的Abs為1.181。當?shù)鞍仔蛄蠳端的一個氨基酸為蛋氨酸時，在哺乳動物網(wǎng)狀紅細胞體外表達的半衰期為30 h，在酵母和大腸埃希桿菌中體內(nèi)表達的半衰期分別大于20 h和10 h。在液體環(huán)境中的不穩(wěn)定指數(shù)為50.32，高于閾值40，在溶液中性質(zhì)不穩(wěn)定。其疏水指數(shù)為76.60，總的親水性為-0.675，蛋白質(zhì)的總體呈疏水性。

3.3蛋白質(zhì)亞細胞定位、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)預測

該蛋白存在于細胞內(nèi)，沒有發(fā)現(xiàn)信號肽系列，也沒有發(fā)現(xiàn)線粒體、葉綠素等定位序列，為非分泌性蛋白。同時，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

3.4B細胞表位分析

利用BepiPred分析對該蛋白質(zhì)上的B細胞線性表位進行了分析，發(fā)現(xiàn)它可能有9個潛在的抗原表位（aa15-aa22，aa50-aa54，aa82-aa92，aa121-aa127，aa141-aa155，aa161-aa169，aa197-aa202，aa210-aa226，aa240-aa256）。相應表位的序列見表1。

表1　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta抗原肽分布Table 1The epitopes distribution of Eg14-3-3zeta

3.5蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測

預測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋（H）為主，占74.6％；β折疊（E）占52％，無規(guī)則卷曲（T）占13.3％，見圖3。

3.6蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測

應用Swiss-model在線分析系統(tǒng)和三維視屏程序?qū)毩＜蚪{蟲14-3-3zeta進行三維結(jié)構(gòu)的同源建模，并將多聚體結(jié)合位點和多肽結(jié)合位點以聚集成團的方式顯示出來，見圖4。

3.7同源性和進化樹分析

將已知的其他物種的14-3-3zeta，包括人（NP_663723.1）、大鼠（NP_037184.1）、惡性瘧原蟲（AAC17516.1）、華支睪吸蟲（AE089649.1）、曼氏迭宮絳蟲（AGC74030.1）、馬來布魯絲蟲（CDP94500.1）、多房棘球絳蟲（CDJ05598.1）、小口膜殼絳蟲（CDS31680.1）與細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的推測氨基酸序列進行多序列比對，結(jié)果如圖5所示，圖中顯示了細粒棘球絳蟲14-3-3zeta與多房棘球絳蟲、小口膜殼絳蟲的親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，同源性分別為99％和86％。同時，我們將Eg14-3-3zeta與人和大鼠的14-3-3zeta進行了全長序列的對比，顯示了細粒棘球絳蟲與人和大鼠在該基因上的同源程度分別為60％和56％，結(jié)果如圖6所示。

圖3　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的二級結(jié)構(gòu)Figure 3The secondary structure of Eg14-3-3zeta by predictprotein

圖4　Swiss-model分析細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的三維結(jié)構(gòu)Figure 43D structure model of Eg14-3-3zeta

圖5　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的分子進化樹Figure 5Molecular evolution tree of the Eg14-3-3zeta

圖6　細粒棘球絳蟲14-3-3zeta與其他物種14-3-3zeta的序列比對Figure 6Alignment of Eg14-3-3zeta amino acid sequence with 14-3-3zeta from other species

4　討論

14-3-3蛋白廣泛存在于植物、酵母、蠕蟲、原蟲、昆蟲以及人類等多種哺乳動物真核細胞內(nèi)，是高度保守的多功能蛋白質(zhì)，它能夠與靶蛋白磷酸化的絲氨酸或蘇氨酸的位點結(jié)合，參與細胞內(nèi)信號傳遞，在細胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡、免疫應答反應以及腫瘤的轉(zhuǎn)化等過程中都起到非常重要作用［8-9］。14-3-3蛋白在細胞信號傳導代謝過程中與一些病理反應密切相關(guān)，因此以信號通路作為靶點進行疾病治療是目前生物學界研究的熱點。而在寄生蟲中，14-3-3蛋白功能主要體現(xiàn)為調(diào)節(jié)蟲體的增殖和發(fā)育，在不同的生長階段，例如幼蟲、成蟲、蟲卵，都存在著不同的14-3-3蛋白異構(gòu)體調(diào)節(jié)與發(fā)育相關(guān)蛋白的活性［10］，因此將其作為疫苗候選分子也獲得了肯定［11］。有文獻報道，弓形蟲14-3-3蛋白能夠誘導BALB/c小鼠產(chǎn)生有效的免疫應答，說明其具有一定的抗原性和免疫原性，是一種新型的疫苗候選分子［12］，而這為14-3-3蛋白作為其它寄生蟲疫苗和藥物靶蛋白的研究提供了堅實的基礎(chǔ)。有研究表明，14-3-3蛋白廣泛存在于血吸蟲的成蟲及蟲卵中，是血吸蟲成蟲及蟲卵排泄分泌物中的高豐度蛋白質(zhì)分子，因此信號傳導蛋白14-3-3可作為血吸蟲高豐度循環(huán)抗原之一，具有一定的診斷價值［13］。

本研究運用了生物信息學技術(shù)對細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能進行預測和分析，該基因全長為771 bp，編碼256個氨基酸，其編碼的蛋白相對分子量理論預測值和等電點分別是29.4 kDa和5.04，屬于非穩(wěn)定性蛋白，蛋白質(zhì)的總體呈疏水性，定位于細胞內(nèi)，這有助于采取合理的克隆和表達方法，提高目的蛋白的表達效率，獲得活性重組蛋白。預測該蛋白無信號肽和跨膜區(qū)，二級結(jié)構(gòu)含8個α-螺旋和12個β-折疊股，氨基酸序列中有9個潛在抗原表位。三維結(jié)構(gòu)和功能域預測結(jié)果顯示，細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白有多個多肽結(jié)合位點和多聚體結(jié)合位點，說明該蛋白能夠與多種配體結(jié)合成為信號轉(zhuǎn)導和細胞周期調(diào)控介質(zhì)，通過相互之間的作用，參與多種生物學功能，這也提示了14-3-3zeta在蟲體生長發(fā)育、生理代謝等過程中有重要作用。分子進化分析可見細粒棘球絳蟲14-3-3zeta與多房棘球絳蟲、小口膜殼絳蟲的親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，同源性分別為99％和86％。但是14-3-3zeta與人和大鼠在該基因上的同源程度分別為60％和56％，并且進化分析親緣性較遠，這提示了14-3-3zeta具有潛在的診斷價值。綜上所述，我們初步認識了細粒棘球絳蟲14-3-3zeta蛋白的基本特征，這有利于我們今后合理的設(shè)計實驗方案，深入了解細粒棘球絳蟲14-3-3zeta的生物學功能，及其在蟲體生長發(fā)育和致病過程中的作用，判定該蛋白是否有望能成為細粒棘球蚴病的防治和診斷的一個重要靶標。

［1］古努爾·吐爾遜，米曉云，等.細細粒棘球絳蟲成蟲表膜糖抗原的免疫性分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2012，45（22）：4713-4719.［2］Zhang W，Wang S，McManus DP.Echinococcus granulosus genomics：a new dawn for improved iagnosis，treatment，and control of echinococcosis［J］.Parasite，2014，21（66）：1-5.

［3］林宇光，盧明科，洪凌仙.我國棘球絳蟲及棘球蚴病研究進展［J］.中國人獸共患病學報，2012，28（6）：616-627.

［4］廣劍冰，馬秀敏，魏曉麗，等.細粒棘球絳蟲eg95基因疫苗和重組抗原誘導小鼠免疫應答的比較研究［J］.中國人獸共患病學報，2006，22（4）：5.

［5］Benito A，Carmena D.Double-antibody sandwich elisa using biotinylated antibodies for the detection of echinococcus granulosus coproantigens in dogs［J］.Acta Trop，2005，95（1）：9-15.

［6］Hernandez-Gonzalez A，Muro A，Barrera I，et al.Usefulness of four different echinococcus granulosus recombinant antigens for serodiagnosis of unilocular hydatid disease（uhd）and postsurgical follow-up of patients treated for uhd［J］.Clin Vaccine Immunol，2008，15（1）：147-153.

［7］Li J，Zhang WB，Loukas A，et al.Functional expression and characterization of echinococcus granulosus thioredoxin peroxidase suggests a role in protection against oxidative damage［J］.Gene，2004，326，157-165.

［8］Wang X，Chen W，Li X，et al.Identification and molecular characterization of a novel signaling molecule 14-3-3 epsilon in Clonorchissinensis excretory/secretory products［J］.Parasitol Res，2012，110（4）：1411-1420.

［9］孫敏，何深一，趙廣會，等.剛地弓形蟲14-3-3蛋白真核表達載體的構(gòu)建與表達［J］.中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志，2012，30（6）：438-441.

［10］Pan D，Bera AK，De S，et al.Relative expression of the 14-3-3 gene in different morphotypes of cysts of Echinococcus granulosus isolated from the Indian buffalo［J］.J Helminthol，2010，84（4）：394-397.

［11］Siles-Lucas M，Merli M，Gottstein B.14-3-3 proteins in Echinoco-ccus：their role and potential as protective antigens［J］.Exp Parasitol，2008，119（4）：516-523.

［12］Meng M，He S，Zhao G，et al.Evaluation of protective immune responses induced by DNA vaccines encoding Toxoplasma gondii surface antigen 1（SAG1）and 14-3-3 protein in BALB/c mice［J］.Parasit Vectors，2012，26（5）：273.

［13］Luo QL，Qiao ZP，Zhou YD，et al.Application of signaling protein 14-3-3 and 26 kDa glutathione-S-transferase to serological diagnosis of schistosomiasis japonica［J］.Acta Trop，2009，112（2）：91-96.

Application of bioinformatic analysis in 14-3-3zeta protein of Echinococcus granulosus

FU Ruijia，LV Gang，YIN Feifei，LIANG Pei★
（School of Tropical and Laboratory Medicine，Hainan Medical University，Haikou，Hainan，China，571101）

ObjectiveTo predict and analyze the structure and function of 14-3-3zeta protein from Echinococcus granulosus by bioinformatics technology.MethodsThe structure and function of Eg14-3-3zeta protein was identified from two biological information sites，USA National Center for Biotechnology Information（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），and Expert System for analysis of protein of the Swiss Institute of bioinformatics（ExPASY，http：//expasy.org/），which offer the analysis of various related gene and protein sequence，structure information tools，and other bioinformatics analysis software.ResultsThe fulllength cDNA sequence encoding Eg14-3-3zeta included a complete open reading frame（ORF）of 771 bp coding to a putative protein with 256 amino acids.Molecular weight of Eg14-3-3zeta was predicted to be 29.4 kDa and its isoelectric point was 5.04.The protein had no signal peptide site and transmembrane domain.Secondary structure of Eg14-3-3zeta contained 8 alpha-helices and 12 beta-strands.There were 9 potential epitopes in the sequence of amino acids of Eg14-3-3zeta.ConclusionThe characteristics of 14-3-3zeta protein from Echinococcus granulosus was identified.

Echinococcus granulosus；14-3-3zeta；Bioinformatics；Structure；Function

·論著·

國家自然科學基金（81260254）；海南省自然科學基金（814289）

海南醫(yī)學院熱帶醫(yī)學與檢驗醫(yī)學院，海南，?？?71101

梁培，E-mail：liangpeilp@163.com