奚功芳, 周守標(biāo)， 姚春霞

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，上海 201403； 2.安徽師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，安徽蕪湖 241003)

洛克沙胂(Roxarsone，ROX)化學(xué)名稱是3-硝基-4-羥基苯胂酸，因其能夠促進(jìn)動物血液循環(huán)，刺激生長，并具有一定的抗菌、抗寄生蟲等藥理作用，作為飼料添加劑而被畜禽養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。但畜禽對洛克沙胂的吸收很少，大部分未經(jīng)轉(zhuǎn)化即經(jīng)糞尿排出體外[2]。洛克沙胂雖然本身并沒有毒性，但隨著堆肥或者灌溉的形式進(jìn)入環(huán)境之后，經(jīng)降解轉(zhuǎn)化可轉(zhuǎn)變成其他形態(tài)，毒性加強(qiáng)[3，4]，可對生態(tài)環(huán)境造成較大影響并且通過食物鏈對人體健康造成危害。研究表明[5，6]，豬場周邊環(huán)境中砷含量明顯高于其他地區(qū)，這與利用含洛克沙胂的有機(jī)肥密切相關(guān)。畜禽糞便是洛克沙胂進(jìn)入環(huán)境的主要媒介[7]，為有效控制環(huán)境中砷含量，因此，建立有機(jī)肥中洛克沙胂的檢測方法具有重要意義。

目前，洛克沙胂的檢測方法主要有液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法(LC-HG-AFS)[8]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)[9]、毛細(xì)管電泳-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(CE-ICP-MS)[10]、離子色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(IC-ICP-MS)[11]及高效液相色譜法(HPLC)[12]等。上述方法多為測定飼料或飼料添加劑中洛克沙砷的含量,用HPLC法檢測有機(jī)肥中洛克沙砷含量的報道則較少。本文選用高效液相色譜建立檢測有機(jī)肥中洛克沙胂的分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑和材料

Waters 2690型高效液相色譜儀(美國，Waters 公司)，Waters 2487紫外檢測器；MAX固相萃取小柱(60 mg/3mL，北京市廣譜達(dá)科技有限公司 )；HGC-24A氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)。

洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品(99.0%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)儲備液：準(zhǔn)確稱取10.10 mg洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇超聲助溶后定容，配制成100 mg·L-1的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。洛克沙胂工作液：?zhǔn)確吸取100 mg·L-1的洛克沙胂的標(biāo)準(zhǔn)儲備液1 mL于10 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，配成10 mg·L-1的洛克沙胂工作液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。甲?色譜級)；K2HPO4(分析純)；NaH2PO4(分析純)，甲酸(分析純)，H3PO4(分析純)，CuSO4(分析純)，氨水(分析純)，乙酸鈉(分析純)，乙酸(分析純)，超純水。

有機(jī)肥樣品采集于上海市養(yǎng)殖場，于-20 ℃貯存，臨用前解凍干燥，粉粹后過100目篩，洛克沙胂的背景值為零。

1.2 色譜條件

色譜柱：Symmetry ShieldTMRP 18柱(150×4.6 mm,3.5 μm,美國Waters)；流動相：含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)，等度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；紫外檢測波長：266 nm。流動相：按含0.1%甲酸(V/V)的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)比例配制，混勻后用0.45 μm的微孔濾膜過濾，然后超聲脫氣15 min，現(xiàn)配現(xiàn)用。淋洗液：0.05 mol·L-1乙酸鈉∶甲醇=95∶5(V/V)，用1%的乙酸將其pH調(diào)至7。洗脫液：甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)。

1.3 樣品處理

1.3.1提取準(zhǔn)確稱取有機(jī)肥樣品0.5 g于50 mL的聚丙烯離心管中，添加一定量已知濃度的洛克沙胂溶液于其中，混勻，置于4 ℃冰箱中靜置1 h后，加入提取劑10 mL，渦旋2 min，于溫度60 ℃下超聲提取30 min，在4 500 r·min-1下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一50 mL離心管中。殘渣再加入10 mL提取劑重復(fù)上述操作2次，合并上清液，加入2 mL 100 g·L-1CuSO4沉淀蛋白，靜置30 min，然后于4 500 r·min-1下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，用10%的氨水將提取液的pH調(diào)至6～7，取3 mL提取液上固相萃取小柱凈化。

1.3.2樣品凈化先用3 mL甲醇和3 mL超純水活化固相萃取小柱?；罨?，取提取液3 mL上凈化小柱，再先后用3 mL淋洗液和甲醇沖洗小柱，淋洗后再用5 mL洗脫液以1.0 mL·min-1的流速洗脫洛克沙胂，收集洗脫液并于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，? mL超純水渦旋并超聲溶解，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液供HPLC檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑和提取方式的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)報道[7,9],本實驗比較了0.1 mol·L-1NaH2PO4-H3PO4(9∶1,V/V)、0.1 mol·L-1H3PO4及20 g·L-1K2HPO4三種提取劑，以及振蕩和超聲兩種方式下提取有機(jī)肥中洛克沙胂。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種提取劑在不同提取方式下對有機(jī)肥中洛克沙胂的提取率都很高。其中，在超聲條件下洛克沙胂的回收率要高于振蕩提取方式，并且在超聲提取方式下選用20 g·L-1K2HPO4作提取劑時，洛克沙胂的加標(biāo)回收率最高，達(dá)86.80%，相對偏差為1.63%，且提取劑比黃連喜等[13]使用的提取劑簡單，易于操作，故本實驗選擇20 g·L-1的K2HPO4作為提取劑在超聲條件下提取有機(jī)肥中的洛克沙胂。另外，由于有機(jī)肥中雜質(zhì)成分較多，含有大量的蛋白質(zhì)，這些都會對洛克沙胂的的出峰時間及峰形產(chǎn)生一定的干擾，因此，本實驗采用100 g·L-1的CuSO4來沉淀有機(jī)肥中的蛋白質(zhì)，去除雜質(zhì)。同時，因?qū)悠啡沃貜?fù)提取，進(jìn)一步保證了有機(jī)肥料洛克沙胂的提取效率。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

根據(jù)固相萃取吸附機(jī)理，洛克沙胂的pKa為3.9，故提取液在上小柱前需用1%氨水將pH調(diào)至6～7之間。肖亞兵等[14]比較了不同固相萃取小樣對樣品的凈化效果，發(fā)現(xiàn)MAX小柱最好，回收率高達(dá) 97% 以上，因此本實驗采用MAX固相萃取小柱對樣品進(jìn)行凈化，并調(diào)節(jié)提取液pH至6～7。根據(jù)MAX固相萃取柱的特點(diǎn)，選擇0.05 mol·L-1乙酸鈉∶甲醇=95∶5(V/V，pH=7)和純甲醇作為淋洗液，采用甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)作為洗脫液。根據(jù)王金榮等[16]提出的增加甲酸在洗脫液中的比例可以提高洗脫回收率，本實驗比較了不同比例的甲酸∶甲醇，發(fā)現(xiàn)甲酸為8%時，洗脫回收率最高，因此洗脫液采用甲酸∶甲醇=8∶92(V/V)。

2.3 流動相的選擇

根據(jù)相關(guān)研究[15]，本實驗以甲醇作為有機(jī)改良劑，比較了100%的0.1%的三氟乙酸 、0.1%的三氟乙酸∶甲醇=95∶5(V/V)、含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)及含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=90∶10(V/V)四種流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用磷酸鹽做流動相時有助于改善洛克沙胂的峰形，并且當(dāng)流動相中加入甲醇時，有助于縮短洛克沙胂的保留時間，當(dāng)流動相中甲醇的比例為5%時，洛克沙胂的出峰時間在6 min左右，并且避開了試劑峰的干擾。故本實驗最終選擇含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)作為流動相。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

將不同濃度梯度的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析，每個濃度重復(fù)測定5次。以進(jìn)樣濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，洛克沙胂在0.05～10.0 mg·L-1范圍檢測的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999，取信噪比(S/N)≥3時的濃度為檢出限,洛克沙胂的檢出限為20 μg·L-1。檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于白亞楠等人[16]利用HPLC法檢測雞糞便中洛克沙胂的檢出限170 μg·L-1。

2.5 精密度及回收率實驗

2.5.1精密度實驗準(zhǔn)確稱取0.5 g空白有機(jī)肥于50 mL離心管中，分別加入一定量已知濃度的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)1.3節(jié)處理后，最終進(jìn)樣濃度分別是6、3及1.5 mg·L-1，進(jìn)行HPLC檢測,每個濃度的樣品同日內(nèi)重復(fù)測定5次，重復(fù)5 d。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算洛克沙胂的濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，求出洛克沙胂的日內(nèi)和日間變異系數(shù)。結(jié)果表明，方法的變異系數(shù)介于0.053%～2.04%之間，明顯低于陳冬梅等人[17]的4.3%，洛克沙胂的日間和日內(nèi)的變異系數(shù)較小，重現(xiàn)性好，精密度高，表明此方法適用于有機(jī)肥中洛克沙胂的檢測。

2.5.2加標(biāo)回收率準(zhǔn)確稱取0.5 g空白有機(jī)肥，分別加入一定量的已知濃度的洛克沙胂標(biāo)準(zhǔn)溶液。經(jīng)1.3節(jié)處理后，最終樣品中洛克沙胂進(jìn)樣濃度分別是6、3及1.5 mg·L-1。結(jié)果表明(表1)，肥料中洛克沙胂的回收率較高，各濃度的平均回收率的范圍在81.14%～82.75%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.63%～7.04%范圍，并且回收率高于曾婧等人[18]對利用HPLC法檢測雞排泄物中洛克沙胂的74.4%。說明此方法檢測有機(jī)肥中洛克沙胂時回收率高并且重復(fù)性良好。

表1 有機(jī)肥中洛克沙胂的回收率(n=3)

2.6 實際樣品分析

從某一長期使用洛克沙胂添加劑的養(yǎng)殖場采集有機(jī)肥樣品2個，經(jīng)風(fēng)干，研碎過100目篩之后裝于自封袋中待用。樣品經(jīng)前處理后，上機(jī)檢測，該養(yǎng)殖場有機(jī)肥中洛克沙胂含量的平均值為9.89 mg·kg-1。

3 結(jié)論

本研究采用HPLC法測定有機(jī)肥中的洛克沙胂含量，選用組成簡單的含0.1%甲酸的0.05 mol·L-1KH2PO4∶甲醇=95∶5(V/V)作為流動相，洛克沙胂的保留時間短，峰形良好，并且目標(biāo)峰附近無雜質(zhì)峰干擾。該方法精密度高，重現(xiàn)性好，線性范圍寬，檢出限低，適用于有機(jī)肥中洛克沙胂檢測。