王 丹， 萬慧慧， 張 華

(精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連理工大學(xué)，遼寧大連 116024)

二十二碳六烯酸(DHA)是Omega-3多不飽和脂肪酸，它能健腦明目，在預(yù)防心腦血管疾病、抑制腫瘤生長、抗炎及抑制過敏反應(yīng)等方面也有一定作用[1]。國內(nèi)外對DHA的樣品前處理方法有超聲提取(UE)[2]、液液萃取(LLE)[3]、固相萃取(SPE)[4,5]和超臨界流體萃取(SFE)[6]等。SPE能同時完成樣品的富集與純化，相比UE和LLE提高了檢測的靈敏度，適合批量處理樣品，重現(xiàn)性好，且成本較低。Andréina等[4]和Ruiz[5]等考察了正相SPE柱的萃取效果，本文則對正反兩相4種SPE柱進(jìn)行了比較。而對DHA的檢測方面,有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[11]等。由于DHA的極性較強(qiáng)、揮發(fā)性較低，進(jìn)氣相檢測需要進(jìn)行衍生化處理，而采用液相檢測卻可以免去衍生化過程。許倩等[12]雖使用了LC-MS/MS檢測，但其未加碰撞能量，子離子仍然選擇母離子，而且僅使用LLE純化。

本文利用流動注射法對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的定量子離子和碰撞能量，并選取C18 SPE小柱對血漿樣品進(jìn)行富集和純化，提高了靈敏度。結(jié)合HPLC-MS/MS在選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式下進(jìn)行分析，降低了基質(zhì)干擾，提高了檢測準(zhǔn)確度和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo TSQ Quantum Ultra型三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo公司)；KH-3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水系統(tǒng)(美國，Millipore公司)；Vac Elut SPS 24真空裝置(美國，Agilent公司)；C18 SPE、C18SAX、Silica、NH2SPE小柱(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)。

二十二碳六烯酸(DHA，分析純，Nu-CHEK PREP INC)；2，6-二叔丁基對甲酚(BHT，分析純，國研集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二氯甲烷、正己烷和甲醇(分析純，北京化工廠)；乙腈(色譜純，德國Merck KGaA公司)；甲酸(色譜純，美國DikmaPure公司)。實(shí)驗(yàn)用水取自Milli-Q純水系統(tǒng)。

大白鼠取自大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制稱取DHA標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，加入25 mg BHT,用甲醇配成濃度為250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，儲存于-20 ℃冰箱。移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成DHA濃度分別為0.10、0.20、2.0、10.0、20.0、60.0 μg/mL的80%甲醇水溶液為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2樣品預(yù)處理反相SPE小柱：準(zhǔn)確移取200 μL的大鼠血漿置于10 mL試管中,依次加入200 μL含有0.05%抗氧化劑BHT 的甲醇溶液、3 mL水，震蕩均勻?；罨謩e采用5 mL甲醇和5 mL 10%的甲醇水溶液依次淋洗C18和C18SAX SPE小柱。將上述樣品過小柱后，用2 mL 10%的甲醇水溶液潤洗樣品試管后再淋洗小柱，真空干燥5 min，再用5 mL甲醇溶液(含2%甲酸)洗脫至10 mL試管中，氮?dú)獯蹈?，?0%的甲醇水溶液定容至0.5 mL。正相SPE小柱：準(zhǔn)確移取200 μL的大鼠血漿置于10 mL試管中,依次加入200 μL含有0.05%抗氧化劑BHT的甲醇溶液、3 mL正己烷，震蕩均勻?；罨謩e采用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷依次淋洗Silica和NH2SPE小柱。將上述樣品過小柱后，用2 mL正己烷潤洗樣品試管后再淋洗小柱，真空干燥5 min，再用1 mL甲醇和5 mL二氯甲烷的混合液(含2%甲酸)洗脫至10 mL試管中，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇水溶液定容至0.5 mL。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Thermo C18柱(100×2.1 mm，3 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：0.2%甲酸水溶液-乙腈(體積比20∶80)；流速：200 μL/min。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子掃描選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式，噴霧電壓2.5 kV，氣化溫度40 ℃，鞘氣12 L/min，輔助氣10 L/min，離子傳輸管溫度340 ℃。SRM的質(zhì)譜條件見表1。

表1 DHA的MRM質(zhì)譜檢測條件

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件的優(yōu)化

圖1 (a)5 μg/mL DHA標(biāo)樣的SRM掃描圖；(b)經(jīng)SPE柱純化和經(jīng)LLE純化(c)的大鼠血漿中DHA的SRM掃描圖Fig.1 (a)SRM scan chromatogram of 5 μg/mL of DHA standard；SRM scan chromatogram of DHA in the plasma of rats purified with the SPE column (b) and purified with LLE (c)

優(yōu)化液相色譜條件，有機(jī)相選擇80%體積的乙腈，可在5 min內(nèi)出峰，同時DHA峰與雜質(zhì)峰能實(shí)現(xiàn)很好的分離，也沒有樣品殘留。在水相中添加0.2%的甲酸，可防止DHA色譜峰峰形變差。

利用流動注射法對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，DHA結(jié)構(gòu)中有-COOH，在負(fù)離子模式下有較好響應(yīng)，對碰撞能量的優(yōu)化結(jié)果見表1。大鼠血漿中DHA經(jīng)C18 SPE柱純化的SRM掃描圖，及經(jīng)LLE[3](用氯仿提取)純化得到的SRM掃描圖見圖1。結(jié)果表明，樣品經(jīng)LLE純化得到的SRM掃描圖背景噪音比較大，會影響定量的準(zhǔn)確度，而經(jīng)C18 SPE柱富集純化后則可以明顯降低背景噪音，使結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

2.2 前處理凈化條件的優(yōu)化

考察了C18(6 mL/500mg)、C18SAX(3 mL/100mg)、硅膠柱(Silica，6 mL/500mg)和NH2柱(6 mL/1g)4種SPE小柱對DHA凈化回收效果，結(jié)果見表2。C18SAX柱是強(qiáng)陰離子交換小柱，鍵合的季氨基可以與DHA在水中形成的羧基(-COO-)發(fā)生選擇性吸附，難以洗脫完全，故回收率很低，只有58.0%；NH2柱是以硅膠為基質(zhì)的氨丙基萃取柱，它具有極性固定相和弱陰離子交換劑，當(dāng)用在非極性溶液中進(jìn)行預(yù)處理時，它能與帶有-OH、-NH、-SH官能團(tuán)的分子形成氫鍵，雖然也有一定的死吸附，但NH2柱與陰離子的作用較C18SAX弱，因此回收率比C18SAX相對高一些為82.8%；Silica柱是未經(jīng)鍵合的高純氧化硅(SiO2)，是強(qiáng)極性吸附劑，具有一定的酸性，作用機(jī)理為氫鍵或者偶極相互作用，與同樣偏酸性的DHA作用力則較差些，上樣濃度增大，可能會發(fā)生穿透現(xiàn)象，本文在30 μg/mL加標(biāo)濃度時，發(fā)生了少許穿透，回收率為90.1%，比預(yù)期偏低了一些；C18柱是在高純硅膠基質(zhì)上鍵合了碳十八烷基，對大多數(shù)有機(jī)物都有保留，是應(yīng)用最為廣泛的SPE柱，對DHA的作用力也相對較合適，回收率為103.3%，是4種小柱中最適合富集DHA的SPE柱。

表2 4種SPE小柱對DHA的凈化回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

比較C18和Silica SPE小柱的穿透性：分別采集樣品加標(biāo)濃度為2、10、30、60 μg/mL時過兩SPE小柱后的上樣液，吹干定容后檢測。結(jié)果在加標(biāo)濃度為30 μg/mL時，Silica SPE柱發(fā)生少許穿透，C18 SPE柱在60 μg/mL時仍沒有穿透。綜合考量回收率和穿透性，選擇C18 SPE小柱對DHA進(jìn)行富集純化。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍與檢出限將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用LC-MS/MS測定， DHA的濃度在0.10～60.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，線性方程為：y=14867x+9205.8，r2=0.9990，逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定方法的檢出限(LOD，以S/N=3計)為0.04 μg/mL，定量限(LOQ，以S/N=10計)為0.10 μg/mL。檢出限和定量限較低，可以滿足血漿中DHA含量的分析要求。

表3 回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)

2.3.2方法的回收率和精密度采用血漿樣品為基質(zhì)進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。在樣品中添加3個濃度水平(2、10、30 μg/mL)的DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文方法進(jìn)行富集和檢測，每個添加水平平行測定6次，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。平均回收率范圍為94.0%～107%，RSDs在2.15%～3.12%之間(表3)，方法的回收率和精密度均較好。

2.3.3重復(fù)性和穩(wěn)定性平行取6份大鼠血漿樣品，經(jīng)過SPE柱富集純化后，制備6份供試品溶液，按照本文方法進(jìn)行LC-MS/MS檢測，測得DHA含量的RSD為3.68%(n=6)，方法重復(fù)性較好。將上述6份供試品溶液，放置在冰箱中-20 ℃保存，經(jīng)1、2、3 d后分別再次進(jìn)行檢測，測得6份溶液中DHA含量的RSDs范圍在2.24%～4.13%之間，結(jié)果表明，樣品在-20 ℃保存至少可以穩(wěn)定3 d。

2.4 實(shí)際樣品測定

取10份不同批次的大鼠血漿樣品各200 μL，按文中方法進(jìn)行C18 SPE柱富集和檢測，結(jié)果表明，這些大鼠血漿中DHA濃度在1.12～2.05 μg/mL之間，因此本方法線性范圍可滿足實(shí)際樣品分析。

3 結(jié)論

本文選擇C18 SPE小柱對大鼠血漿樣品進(jìn)行富集和純化，結(jié)合HPLC-MS/MS在SRM模式下對DHA進(jìn)行分析，降低了基質(zhì)干擾，避免了氣相色譜的衍生化過程，提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。由于脂肪酸的結(jié)構(gòu)相似，該方法有望用于人體或大鼠等動物血漿中多種脂肪酸含量的同時分析；另外動物的腦、肝、眼、心臟等部位樣品經(jīng)勻漿和溶劑粗提后，也可應(yīng)用此方法測定其中的脂肪酸含量。