唐 榮， 李 琛， 葉志強(qiáng)， 張德蒙， 馬小軍， 譚明乾*， 袁景利

(1.大連理工大學(xué)精細(xì)化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116023； 2.中科院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部,遼寧大連 116023； 3.長春市疾病預(yù)防控制中心，吉林長春 130033)

熒光碳點(diǎn)作為碳納米材料家族的新成員，因具有突出的性能，例如：良好的水溶性和光穩(wěn)定性、無光眨眼、抗光漂白、低的細(xì)胞毒性，以及良好的生物相容性等，受到越來越多的關(guān)注[1 - 4]。熒光碳點(diǎn)的顯著特性在于其激發(fā)光譜較寬，且發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長的變大而發(fā)生紅移，可發(fā)出不同顏色的熒光[5]。熒光碳點(diǎn)的合成方法已有很多文獻(xiàn)報(bào)道，主要有激光消融法[6]、電化學(xué)法[7]、化學(xué)氧化法[8]、水熱法[9]以及微波法[10]等。這些合成方法大多是通過一步合成形成熒光碳點(diǎn)，操作簡單。另外，可以用來合成熒光碳點(diǎn)的原料來源廣泛，例如草木灰[11]、有機(jī)小分子[12]、糖類[13，14]以及面包食品[15]等均可以用來制備熒光碳點(diǎn)。合成熒光碳點(diǎn)的原料來源廣泛和合成方法簡單為其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

熒光碳點(diǎn)良好的生物相容性和較低的細(xì)胞毒性，使其在生物成像領(lǐng)域[5,16，17]得到廣泛的應(yīng)用。隨著研究的進(jìn)展，熒光碳點(diǎn)的應(yīng)用已經(jīng)不再局限于生物成像，研究者們利用熒光碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性好、無光閃爍等優(yōu)點(diǎn)，將其用于光催化[18]和LED燈[19]中。由于合成熒光碳點(diǎn)的原料大部分為含碳的有機(jī)物質(zhì)，因此在反應(yīng)的過程中表面會(huì)形成大量的官能團(tuán)，如-NH2、-COOH等，可以直接或間接地用于金屬離子的檢測(cè)[20，21]。因此，熒光碳點(diǎn)的這些優(yōu)良性能及廣譜的應(yīng)用性使其有望成為一種新型的、有潛力的熒光納米材料。

本研究基于熒光碳點(diǎn)的這些優(yōu)良的性能，選擇檸檬酸為碳源，以水熱法合成了表面帶有羧基和羥基的熒光碳點(diǎn)。利用羧基和羥基與Fe(Ⅲ)絡(luò)合導(dǎo)致碳點(diǎn)的熒光猝滅的特性，建立了檢測(cè)Fe(Ⅲ)的新方法，該方法具有良好的選擇性和較寬的線性范圍，并被成功用于自來水中Fe(Ⅲ)的檢測(cè)。同時(shí)還對(duì)檸檬酸熒光碳點(diǎn)進(jìn)行了細(xì)胞熒光成像評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，檸檬酸熒光碳點(diǎn)在金屬離子檢測(cè)和細(xì)胞成像方面有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LS55熒光分光光度計(jì)(美國，PerkinElmer公司)；Burker Vector 22 傅里葉紅外光譜儀 (德國，BRUKER公司)；UV-2550 紫外分光光度計(jì)(日本，島津公司)；FV 1000共聚焦顯微鏡(日本，奧林巴斯公司)；Bruker DRX400核磁共振譜儀(瑞士，Bruker公司)；JEM-2000透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)；動(dòng)態(tài)光散射納米粒徑分析儀(英國，Malvern Instruments公司)。

HEPES(百靈威)，葡聚糖G -25凝膠(上海葉源生物有限公司)，硫酸奎寧(阿拉丁)，氫氧化鈉(中國天津大陸化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(中國天津恒興化學(xué)試劑有限公司)，硼酸(中國天津保地化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(北京化工廠)，檸檬酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠)，三氯化鐵(沈陽市試劑五廠)，氯化鈉、氯化鉀(天津石英鐘廠霸州市化工分廠)，氯化鈣(阿拉丁)，氯化鋇(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)，無水硫酸鎂(沈陽新興試劑廠)，氯化銅(天津市天大化學(xué)試劑廠)。所有試劑為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1碳點(diǎn)的制備以檸檬酸為原料，采用水熱法合成熒光碳點(diǎn)。稱取1.15 g檸檬酸，將其溶于20 mL去離子水中，超聲使其充分溶解。將配好的溶液轉(zhuǎn)入30 mL含有聚四氟乙烯內(nèi)襯的水熱反應(yīng)釜中，于馬弗爐中200 ℃反應(yīng)4 h。待反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)體系自然冷卻到室溫，移出上清液，依次過0.45、0.22 μm的水系濾膜，最終得到淡黃色的碳點(diǎn)溶液。

1.2.2碳點(diǎn)的表征熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜分別使用LS55熒光分光光度計(jì)和UV-2550 紫外分光光度計(jì)，所有的熒光光譜檢測(cè)的狹縫寬度均為10 nm,掃描速度為500 nm/min。熒光猝滅曲線使用FV 1000共聚焦顯微鏡，樣品濃度為19 mg/mL，使用405 nm激光器作為激發(fā)源，功率為13.0%，HV值為700，Gain值為2.00，Offset值為0，掃描速度為2.0 s/Pixel。

時(shí)間分辨熒光使用Horiba Jobin Yvon FluoroMax-4熒光分光光度計(jì)，用376 nm激光器作為激發(fā)光源，發(fā)射波長范圍為390～620 nm，狹縫寬度為6.0 nm,掃描速度為500 nm/min，記錄最大發(fā)射波長447 nm處的熒光壽命。采用Horiba公司提供的商業(yè)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

透射電鏡(TEM)使用功率為200 kV的JEM-2000透射電子顯微鏡觀察。

Zeta電位使用動(dòng)態(tài)光散射納米粒度儀(Zetasizer Nano ZS90，英國Malvern Instruments公司)記錄，樣品濃度為19 mg/mL。

紅外(IR)光譜表征使用Burker Vector 22 傅里葉紅外光譜儀，將樣品與溴化鉀混合研磨制片，記錄500～4 000 cm-1范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)。

1.2.3量子產(chǎn)率的計(jì)算將硫酸喹啉溶于0.1 mol/L的H2SO4中作為標(biāo)準(zhǔn)物，其在360 nm處的標(biāo)準(zhǔn)熒光量子產(chǎn)率值為0.54，用熒光分光光度計(jì)記錄其在360 nm激發(fā)下的發(fā)射光譜，同時(shí)測(cè)量其在360 nm處的吸光度值。所合成的檸檬酸碳點(diǎn)測(cè)量其在310 nm處的吸光度和熒光發(fā)射光譜。以上所測(cè)得的所有熒光發(fā)射光譜都用Origin軟件求得峰面積。熒光碳點(diǎn)的量子產(chǎn)率根據(jù)如下公式計(jì)算：Фx=ФR×(Ix/IR)×(AR/Ax)×(nx/nR)2。式中，I指代熒光發(fā)射曲線的峰面積，A指代吸光光度值，Ф指代熒光量子產(chǎn)率值，n代表溶劑的折射率，下標(biāo)x代表待測(cè)物，下標(biāo)R代表標(biāo)準(zhǔn)物。

1.2.4Fe(Ⅲ)的檢測(cè)在5 mL離心管中依次加入2.3 mL 10 mmol/L HEPES緩沖溶液(pH=7.0)，100 mL 34.3 mg/mL的熒光碳點(diǎn)，100 mL不同濃度的Fe(Ⅲ)溶液，空白加入100 mL去離子水，所有的樣品平行配制三份。熒光光譜的激發(fā)波長皆為310 nm，發(fā)射波長范圍為330～580 nm，狹縫寬度為10 nm，掃描速度為500 nm/min。以415 nm處的熒光強(qiáng)度I對(duì)Fe(Ⅲ)的濃度繪制曲線。

1.3 細(xì)胞標(biāo)記與共聚焦顯微鏡成像

在24孔板中，加入500 mL小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16-F10,6×104cells/mL)懸浮液，使用含10% 胎牛血清及青霉素、鏈霉素各100 U/mL的RPMI1640作為培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。而后將培養(yǎng)液換成含5 mg/mL熒光碳點(diǎn)的RPMI1640，孵育12 h。移去培養(yǎng)液并用PBS溶液洗滌2～3次以除去細(xì)胞外圍的熒光碳點(diǎn)。對(duì)照試驗(yàn)組僅加入不含熒光碳點(diǎn)的培養(yǎng)基，其它操作與試驗(yàn)組完全一致。最后利用FV 1000共聚焦顯微鏡，分別選用405 nm與488 nm激光作為激發(fā)光源，在425～475 nm，500～600 nm范圍采集發(fā)射光信號(hào)進(jìn)行體外細(xì)胞成像。激光器功率為10%，HV值為700，Gain值為2.00，Offset值為0，掃描速度為2.0 s/Pixel，掃描分辨率800成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光碳點(diǎn)的物化性質(zhì)

采用水熱法，以檸檬酸為原料合成的熒光碳點(diǎn)，僅僅需要一種原料，無需強(qiáng)酸堿等苛刻反應(yīng)條件就可以一步制備熒光碳點(diǎn)。從表1中可以看出，所合成的熒光碳點(diǎn)的最大激發(fā)波長為310 nm，最大發(fā)射波長為415 nm。以硫酸喹啉作為參照物，計(jì)算得出所合成的熒光碳點(diǎn)在310 nm處的量子產(chǎn)率(QY)為5.3%。Zeta電位為-35 mV，說明其表面帶有負(fù)電荷，推測(cè)可能含有羧基和羥基。熒光碳點(diǎn)的熒光壽命為5.3 ns。

表1 熒光碳點(diǎn)的物化性質(zhì)

2.2 熒光碳點(diǎn)的透射電鏡表征

圖1為所合成的熒光碳點(diǎn)的透射電鏡(TEM)圖，從圖中可以看出所合成的熒光碳點(diǎn)呈比較規(guī)則的球形，且分布均勻，通過統(tǒng)計(jì)120個(gè)納米粒得到粒徑分布柱形圖，其粒徑主要分布在1.4～5.0 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為2.9 nm。檸檬酸碳點(diǎn)在紫外燈下發(fā)出肉眼可見的明亮藍(lán)色熒光(λex=312 nm)。

圖1 熒光碳點(diǎn)的透射電子顯微鏡(TEM)圖(a)及粒徑統(tǒng)計(jì)分布圖(b)；插圖是熒光碳點(diǎn)在紫外燈下的照片F(xiàn)ig.1 TEM image (a) and particle size histograms (b) of fluorescent carbon dots;Inset is the fluorescence picture under irradiation of ultraviolet lamp

2.3 熒光碳點(diǎn)的紫外-可見吸收和熒光發(fā)射光譜

圖2為熒光碳點(diǎn)的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。從圖中可以看到，用檸檬酸合成的熒光碳點(diǎn)在可見光區(qū)域內(nèi)沒有顯著的吸收峰，但是在200～300 nm之間有明顯吸收。其發(fā)射光譜隨著激發(fā)波長紅移而向長波方向移動(dòng)，且熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與之前文獻(xiàn)所報(bào)道[18]的相一致。其發(fā)射帶較寬，從405 nm一直延伸到520 nm，說明檸檬酸熒光碳點(diǎn)可以發(fā)出多色的熒光。

2.4 熒光碳點(diǎn)的紅外光譜

為了考察檸檬酸以及用其合成的熒光碳點(diǎn)官能團(tuán)的變化，我們做了紅外(IR)光譜表征。如圖3所示，圖中3 295 cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)吸收峰，而形成熒光碳點(diǎn)之后，O-H伸縮振動(dòng)吸收峰由3 295 cm-1處的尖峰變成3 082 cm-1處的寬峰，這可能是由于所合成的熒光碳點(diǎn)更容易形成氫鍵的原因。1 757 cm-1和1 690 cm-1為C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰，因?yàn)闄幟仕岱肿颖旧砗袃煞N類型的羧基，所以才會(huì)在紅外光譜中出現(xiàn)兩種類型的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰。1 402 cm-1為C-H的變形振動(dòng)峰，1 217 cm-1為C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，947 cm-1為二聚體O-H的變形振動(dòng)吸收峰。紅外光譜表征結(jié)果表明，合成的熒光碳點(diǎn)所含有的官能團(tuán)與檸檬酸本身相似，表面含有羧基和羥基，這與我們之前所測(cè)得的Zeta電位為負(fù)值相符。

圖2 熒光碳點(diǎn)的紫外-可見吸收和熒光發(fā)射光譜Fig.2 UV-Vis absorption and fluorescence emission spectra of fluorescent carbon dots

圖3 熒光碳點(diǎn)和檸檬酸(CA)的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of carbon dots and citric acid(CA)

2.5 熒光碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性

光穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)熒光材料的一項(xiàng)重要指標(biāo)。圖4為熒光碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性圖，從圖中可以看出，在405 nm光源激發(fā)，激發(fā)光源激光功率為13%，HV值為700的條件下，經(jīng)過1 000 s照射后，熒光素的熒光強(qiáng)度猝滅為30%，而所合成熒光碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度猝滅僅為7%，說明檸檬酸熒光碳點(diǎn)具有較好的光穩(wěn)定性。該結(jié)果與已經(jīng)報(bào)道的草木灰[11]和天然糖類[22]制備的碳點(diǎn)的光穩(wěn)定結(jié)果相一致。

2.6 熒光碳點(diǎn)的pH穩(wěn)定性

圖5是pH值對(duì)熒光碳點(diǎn)的影響。與利用活性炭合成的熒光碳點(diǎn)不同[23]，從圖5可以看出，所合成的熒光碳點(diǎn)在pH=2～11范圍內(nèi)具有良好的pH穩(wěn)定性。這種性質(zhì)與利用草木灰合成的熒光碳點(diǎn)相似[11]，揭示出檸檬酸熒光碳點(diǎn)的激發(fā)輻射復(fù)合過程不受pH值變化的顯著影響，預(yù)示該種熒光碳點(diǎn)可能在較寬泛的pH范圍內(nèi)具有很好的應(yīng)用前景。

圖4 熒光碳點(diǎn)的光穩(wěn)定性Fig.4 Photostability of carbon dots

圖5 pH對(duì)熒光碳點(diǎn)的影響Fig.5 The effect of pH to carbon dots(CDs) B-R buffer(pH=2-11).cCDs=1.73 mg/mL.λex=310 nm,λem=415 nm.

圖6 熒光碳點(diǎn)對(duì)Fe(Ⅲ)(700 μmol/L)的選擇性Fig.6 Selectivity of carbon dots towards Fe(Ⅲ)(700 μmol/L)

2.7 熒光碳點(diǎn)對(duì)Fe(Ⅲ)的選擇性

圖6是不同金屬離子對(duì)熒光碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，除了Cu(Ⅱ)和Fe(Ⅱ)會(huì)對(duì)碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度產(chǎn)生一定的影響以外，其他的金屬離子幾乎都不會(huì)使熒光碳點(diǎn)的熒光發(fā)生改變，而向熒光碳點(diǎn)中加入700 μmol/L Fe(Ⅲ) 后，熒光碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度幾乎完全被猝滅(熒光強(qiáng)度衰減80%)，說明我們所合成的檸檬酸熒光碳點(diǎn)對(duì)Fe(Ⅲ) 具有較好的選擇性。熒光碳點(diǎn)熒光猝滅的原因，根據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道[24]，可能是因?yàn)镕e(Ⅲ)可以與熒光碳點(diǎn)表面的羥基和羧基發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而產(chǎn)生非特異性相互作用，猝滅了熒光碳點(diǎn)的熒光所致。

2.8 線性范圍與檢出限

考察了不同濃度的Fe(Ⅲ)對(duì)檸檬酸熒光碳點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響。圖7(A)是熒光滴定曲線，圖7(B)是相對(duì)應(yīng)的415 nm處的熒光強(qiáng)度與Fe(Ⅲ)濃度的關(guān)系。結(jié)果表明：隨著F(Ⅲ)濃度的增加，熒光碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度逐漸降低，在100～500 μmol/L范圍內(nèi),熒光碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與Fe(Ⅲ)的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.99,線性方程為:I=-0.20cFe(Ⅲ)+177.93。其中，cFe(Ⅲ)為Fe(Ⅲ)的濃度(μmol/L),I為熒光碳點(diǎn)在415 nm處的熒光強(qiáng)度， 計(jì)算得到檢出限(3S0/k)為112.5 nmol/L。

圖7 (A) 加入不同濃度的Fe(Ⅲ)后熒光碳點(diǎn)的熒光光譜;(B) I415與Fe(Ⅲ)濃度的關(guān)系，插圖為標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 (A) Fluorescence spectra of carbon dots with different concentrations of Fe(Ⅲ);(B) The correlation of Fe(Ⅲ) concentration and fluorescence intensity at 415 nm(I415),inset shows the standard curve

2.9 回收率測(cè)定

為了進(jìn)一步證明熒光碳點(diǎn)可以用來檢測(cè)Fe(Ⅲ)，進(jìn)行了自來水和去離子水樣品的加入回收試驗(yàn)。選取250和300 μmol/L兩個(gè)濃度點(diǎn)，結(jié)果如表2所示。從表中可以看出，無論在自來水還是去離子水中，所合成的熒光碳點(diǎn)對(duì)Fe(Ⅲ)的檢測(cè)都有較好回收率，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)都較小，說明這種方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度。

表2 自來水和去離子水中Fe(Ⅲ)的回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

圖8 檸檬酸熒光碳點(diǎn)(CA-CDs)及對(duì)照組的B16-F10細(xì)胞成像圖。最右列是明場(chǎng)(Bright-field)和藍(lán)色激光(Ex=405 nm)及綠色激光(Ex=488 nm)激發(fā)下的疊加圖。標(biāo)尺為100 μmFig.8 Confocal fluorescence imaging of B16-F10 cells incubated with CA-CDs and medium(control).Right column is the overlay of bright-field and fluorescence image excited with 405 nm laser and 488 nm laser.Scale bar is 100 μm

2.10 細(xì)胞成像

熒光碳點(diǎn)因其優(yōu)良的理化性質(zhì)已經(jīng)被應(yīng)用于活細(xì)胞成像。如圖8所示，將檸檬酸熒光碳點(diǎn)應(yīng)用于小鼠黑色素瘤細(xì)胞的熒光成像。從圖中可以看出檸檬酸熒光碳點(diǎn)跟B16-F10細(xì)胞共孵育12 h后，在405 nm和488 nm激發(fā)光下，細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色或綠色熒光，而熒光信號(hào)主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)。相比較而言，未加入熒光碳點(diǎn)的對(duì)照組細(xì)胞在相同的拍攝條件下卻沒有發(fā)出任何熒光信號(hào)。說明所合成的檸檬酸熒光碳點(diǎn)成功地進(jìn)入到了細(xì)胞內(nèi)，且有部分熒光碳點(diǎn)進(jìn)入到了細(xì)胞核內(nèi)，同時(shí)可以發(fā)出多色熒光，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的多色成像。

3 結(jié)論

本文以檸檬酸為原料，通過水熱法合成了水溶性的熒光碳點(diǎn)，并用來檢測(cè)水樣中的Fe(Ⅲ)及細(xì)胞成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所合成的檸檬酸熒光碳點(diǎn)在310 nm處的量子產(chǎn)率為5.3%，粒徑主要分布在1.4～5.0 nm范圍內(nèi)，平均粒徑為2.9 nm。紅外光譜和Zeta電位表明，在熒光碳點(diǎn)表面分布著-COOH和-OH等帶負(fù)電荷的基團(tuán)。由于表面的-COOH和-OH可以與Fe(Ⅲ)絡(luò)合，使得碳點(diǎn)的熒光猝滅，從而可以用于Fe(Ⅲ)的檢測(cè)。Fe(Ⅲ)濃度在100～500 μmol/L范圍內(nèi)，熒光碳點(diǎn)的熒光強(qiáng)度I與Fe(Ⅲ)濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為112.5 nmol/L。該方法操作簡單，選擇性好，靈敏度高，而且有望用于實(shí)際水樣中Fe(Ⅲ)的檢測(cè)。細(xì)胞成像結(jié)果顯示，所合成的檸檬酸熒光碳點(diǎn)可以同時(shí)進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，并在不同的激發(fā)光源下發(fā)出多色的熒光，說明檸檬酸熒光碳點(diǎn)可以作為熒光探針用于細(xì)胞標(biāo)記。