胡 娜， 索有瑞， 韓麗娟， 索有芳， 王 寧， 尤進(jìn)茂

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,青海西寧 810001；2.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院,青海西寧 810016；3.青海省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，青海西寧 810007；4.中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京100049)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(HippophaeL.)植物(SeaBuekthorn)，又叫醋柳、酸刺、黑刺，為灌木或小喬木[1]。沙棘的天然分布很廣，在歐亞大陸溫帶地區(qū)均有分布。我國(guó)沙棘屬植物資源豐富，而青海沙棘資源約占全國(guó)總沙棘總量的10%。沙棘除作為生態(tài)保護(hù)的先鋒物種[2]，還具有祛痰、利肺、開胃、補(bǔ)脾、活血、祛瘀、消炎、止痛、促進(jìn)組織再生等藥理功能[3]，其維生素C含量之高是其他漿果和水果無(wú)法相比的[4]。在工業(yè)應(yīng)用上，沙棘籽油、黃酮、花青素和維生素E等都是護(hù)膚美容活性成分[5]。其中，沙棘籽油是多種脂溶性維生素和皮脂活性物質(zhì)的復(fù)合體，具有滋養(yǎng)皮膚，促進(jìn)新陳代謝，抗過(guò)敏，殺菌消炎，促進(jìn)上皮組織再生的功能作用[6]。

圖1 BCETS的結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure of BECTS

研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸尤其是不飽和脂肪酸具有重要的生理功能，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜的生長(zhǎng)和發(fā)育、心血管系統(tǒng)具有重要的作用，可以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病、抑郁癥和癌癥等疾病[7]。沙棘種子中脂肪酸成分的測(cè)定目前已有很多報(bào)道，但方法多數(shù)是采用氣相色譜或者氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。本研究以新型熒光衍生試劑2-(11-H-苯-a-咔唑)乙基對(duì)甲苯磺酸酯(BCETS)為柱前熒光衍生試劑(結(jié)構(gòu)見圖1)，利用高效液相色譜-熒光檢測(cè)(HPLC-FLD)并與質(zhì)譜(MS)聯(lián)用對(duì)沙棘種子中的游離脂肪酸組成進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用沙棘果實(shí)提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與條件

Agilent 1100液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Agilent公司)，配備四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、熒光檢測(cè)器和自動(dòng)進(jìn)樣器，大氣壓化學(xué)電離源(APCI)。高效液相色譜系統(tǒng)軟件：HP Chemstation software；質(zhì)譜系統(tǒng)：Esquire-LC NT software；Hypersil BDS C8柱(200×4.6 mm,5 μm,Agilent Co.) ；流動(dòng)相A:100%乙腈，流動(dòng)相B:5%乙腈;洗脫梯度如下：0 min為65%A,35 min為83%A,50 min為88%A,55 min為100%A,60 min為100%A；流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃。熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為279 nm和380 nm。色譜峰按標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品保留時(shí)間定性，并通過(guò)在線質(zhì)譜鑒定，質(zhì)譜條件：大氣壓化學(xué)電離源(APCI)，正離子模式，噴霧壓力60 psi，干燥氣流量為5 L/min，干燥氣溫度350 ℃，Vap溫度450 ℃，毛細(xì)管電壓3 500 V，電暈電流4 000 μA(Pos)。

1.2 試劑與材料

脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司；2-(11-H-苯-a-咔唑)乙基對(duì)甲苯磺酸酯(BCETS)由尤進(jìn)茂教授課題組實(shí)驗(yàn)室合成；光譜純乙腈購(gòu)于Merck公司；N,N′-二甲基甲酰胺(DMF)(濟(jì)寧化學(xué)試劑公司) 經(jīng)減壓蒸餾后使用；色譜純乙腈(禹王試劑公司)；其他試劑均為分析純。純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

于2012年9月份在青海省循化縣白莊鎮(zhèn)蘇乎沙村采集完全成熟的沙棘果實(shí)。分別選取附近4個(gè)不同的采樣點(diǎn)進(jìn)行采樣，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所周昌范工程師鑒定為沙棘(HippophaerhamnoidesL.)的果實(shí)。將榨完果汁剩下的果渣進(jìn)行清洗，去除果皮，保留種子，并將洗干凈的沙棘種子于60 ℃烘箱中烘至恒重。取20 g干燥好的沙棘種子，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與衍生稀釋各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液(0.01 mol/L)得各低濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。準(zhǔn)確稱取22.15 mg BCETS，用DMF定容至10 mL。標(biāo)準(zhǔn)品溶液衍生：向盛有15 mg無(wú)水K2CO3的2 mL安培瓶中依次加入30 μL標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液，120 μL BCETS溶液，150 μL DMF，封口后于90 ℃恒溫水浴下反應(yīng)30 min。反應(yīng)完畢，冷卻，過(guò)0.22 μm濾膜后，待分析。

1.3.2脂肪酸供試液的制備與衍生精確稱取約100.0 mg樣品至10 mL具塞刻度試管中，加入5 mL石油醚，超聲提取1 h，取100 μL用N2吹干后，加入100 μL的DMF和200 μL的衍生試劑，封口后于溫度90 ℃恒溫水浴下衍生30 min，然后加入250 μL乙腈稀釋，過(guò)0.22 μm濾膜，放入冰箱備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC分離及MS鑒定

圖2 標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of fatty acid derivatives from 20 fatty acid standardsPeak labels:C10(decoic acid);C11(undecanoic acid);C12(dodecanoic acid);C13(tridecanoic acid);C18∶3(8,11,14-octadecatrienoic acid);C14(myristic acid);C16∶1(palmitoleic acid);C18∶2(9,12-octadecadienoic acid);C15(pentadecanoic acid);C16(hexadecanoic acid);C18∶1(12-octadecenoic acid);C17(heptadecanoic acid);C18(octadecanoic acid);C20∶1(11- eicosenoic acid);C19(nonadecanoic acid);C20(arachidic acid);C21(heneicosoic acid);C22(docosanoic acid);C23(tricosanoic acid);C24(tetracosanoic acid).

按上述實(shí)驗(yàn)條件，20種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸衍生物獲得完全分離，代表譜圖見圖2。各組分經(jīng)液相色譜分離熒光檢測(cè)后，直接進(jìn)入柱后串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行定性鑒定，20種脂肪酸的衍生物一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。代表性的BCETS-C18∶1脂肪酸的MS、MS/MS和裂解模式分析見圖3。

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

優(yōu)化條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液平行6次進(jìn)樣測(cè)定，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各衍生物均表現(xiàn)出良好的線性，其相關(guān)系數(shù)(r)≥0.9995，線性范圍是1.562～50 mmol/L。檢測(cè)限(LOD)(S/N=3)在0.42～1.82 ng/mL之間，定量限(LOQ)(S/N=10)在1.34～6.64 ng/mL之間，證明該方法具有較高的靈敏度。將已知量的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品加入樣品，加標(biāo)樣品用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，包括提取、衍生和進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。依據(jù)公式計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各脂肪酸的加標(biāo)回收率在92.6%～101.9%范圍內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.89%～4.91%之間，表明這種方法具有較好的準(zhǔn)確度和精確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1。

2.3 沙棘種子中游離脂肪酸分析

按上述實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)實(shí)際樣品衍生后進(jìn)行色譜分離及質(zhì)譜鑒定，色譜分離見圖4。由于所采四個(gè)樣點(diǎn)中沙棘種子中脂肪酸含量相差不大，故僅以4個(gè)采樣點(diǎn)種子中脂肪酸含量的平均值進(jìn)行說(shuō)明。由圖4可知，

表1 脂肪酸衍生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、重現(xiàn)性與精確度

圖3 油酸(C18∶1) 質(zhì)譜圖及其質(zhì)譜裂解模式 Fig.3 MS and MS/MS spetrum of representative oleinic acid (C18∶1) derivative and the cleavage mode of protonated molecular ion

圖4 沙棘種子種脂肪酸衍生物的色譜分離圖Fig.4 Chromatogram of fatty acid derivatives from seeds of Hippophae rhamnoides L.

沙棘種子中主要含有的不飽和脂肪酸為亞油酸(C18∶2)，亞麻酸(C18∶1)和油酸(C18∶3)。另外還含有少量的棕櫚油酸(C16∶1)。飽和脂肪酸主要以棕櫚酸(C16)和硬脂酸(C18)為主，含有少量的十三酸(C13)、肉豆蔻酸(C14)、花生酸(C20)、山崳酸(C22)和木蠟酸(C24)。沙棘種子中所含脂肪酸含量分別為：C13(49.0 μg/g),C18∶3(1060.5 μg/g),C14(26.6 μg/g),C16∶1(1060.5 μg/g),C18∶2(2325.3 μg/g),C16(528.6 μg/g),C18∶1(1959.1 μg/g),C18(277.3 μg/g),C20(188.3 μg/g),C22(27.4 μg/g),C24(32.5 μg/g)。由上述數(shù)據(jù)可知，總不飽和脂肪酸含量(6405.4 μg/g)遠(yuǎn)高于總飽和脂肪酸含量(1129.7 μg/g)，且不飽和脂肪酸約占總脂肪酸的85.01%。

3 結(jié)論

本文采用柱前衍生液相色譜-熒光檢測(cè)/質(zhì)譜聯(lián)用的方法，對(duì)脂肪酸成分進(jìn)行分析，并對(duì)所建立的方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單、快速、檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度和精確度高,可用于植物中脂肪酸的成分分析。該方法被成功的應(yīng)用于沙棘種子中的脂肪酸成分分析，結(jié)果表明：沙棘種子中含有大量的不飽和脂肪酸，其比例可占總脂肪酸的85.01%。不飽和脂肪酸中主要以亞油酸、油酸和亞麻酸為主，分別為總脂肪酸的30.86%、26.01%和14.07%。