宋麗芳， 王 征， 鄔期望， 沈 宏*

(1.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江杭州 310058； 2.解放軍杭州療養(yǎng)院，浙江杭州 310007)

水體含有豐富的K+，是人體攝取K+的重要來源。K+是一種重要的生理元素， 在平衡細(xì)胞滲透壓，調(diào)節(jié)體內(nèi)其他離子濃度方面起著重要作用[1]。體內(nèi)K+濃度失衡與心律失常、高血壓、腎功能障礙等疾病都有一定的關(guān)聯(lián)。所以建立高靈敏、高特異性的測定生物體及環(huán)境水體中K+的分析方法非常重要。

生物體內(nèi)的基因組中含有大量G -四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，主要分布在啟動子區(qū)和端粒區(qū)，可以調(diào)控基因表達(dá)、降低端粒酶活性、穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)，并與多種癌癥疾病相關(guān)[2，3]；在體外，一些富含鳥嘌呤的寡核苷酸鏈可在K+的參與下形成四聯(lián)體分子，若進(jìn)一步結(jié)合血紅素，則轉(zhuǎn)化為具有類辣根過氧化物酶活性的DNA酶，催化H2O2的氧化反應(yīng)[4 - 6]。近年來，基于K+對G -四聯(lián)體分子形成的穩(wěn)定作用，進(jìn)行K+分析的新方法備受關(guān)注[7]，常見的有熒光法[4]和分光光度法[5]。熒光法靈敏度較高[8]，但受熒光基團(tuán)性質(zhì)的制約，常需在非水介質(zhì)中進(jìn)行，且標(biāo)記反應(yīng)較費(fèi)時(shí)，標(biāo)記物較昂貴。分光光度法操作簡便，一般通過催化氧化2，2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)或3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)等顯色劑實(shí)現(xiàn)定量分析，但存在ABTS的氧化產(chǎn)物不穩(wěn)定、易褪色，TMB的顯色較慢(大于10 min)等缺點(diǎn)[9]。另外，基于DNA酶催化魯米諾-H2O2的化學(xué)發(fā)光檢測法也有報(bào)道[10]，該法雖然具有靈敏度高、儀器簡單的優(yōu)點(diǎn)，但試樣、試劑消耗量大(一般大于12 pmol DNA/次)[10]。

本文采用基于微流控技術(shù)的順序注射化學(xué)發(fā)光方法，以雙螺旋通道微芯片作為發(fā)光試劑和DNA酶的在線混合池和信號采集區(qū)，建立了一種簡單、快速檢測K+的方法，試劑消耗量少(1 pmol DNA/次)，檢測通量高(60 h-1)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV2200PC(上海舜宇恒平科學(xué)儀器)；K640型熱循環(huán)儀(杭州晶格科學(xué)儀器)；PHD -2000微量注射泵(美國，哈佛儀器公司)；WFX-120B原子吸收分光光度儀(北京瑞利分析儀器公司)；自制微順序注射化學(xué)發(fā)光分析儀，包括光電倍增管(PMT)(日本濱松電子)，帶有三通閥的順序注射泵(SP)和六通閥(SV)(美國科龍公司)，雙螺旋微流控玻璃芯片[11](50 μm深，300 μm寬)，數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)(Data Card)(杭州揚(yáng)程科技有限公司)。

寡核苷酸PS5. M (5′-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG -3′)，PS2. M (5′-GTGGGTAGGGCGGGTTGG -3′) 購于英濰捷基上海貿(mào)易有限公司。魯米諾購于美國Fluka公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)，氯化血紅素(Hemin)，二甲基亞砜(DMSO)，Triton X-100，H2O2，KCl，MgCl2，NH4Cl，LiCl，NaCl，CaCl2均為分析純，購于上海國藥集團(tuán)。寡核苷酸用pH=8.0的10 mmol·L-1Tris -HCl緩沖液配成100 μmol·L-1的儲備液，-20 ℃儲存。血紅素溶于DMSO，配成500 μmol·L-1儲備液，使用前根據(jù)需要稀釋。反應(yīng)緩沖液由25 mmol·L-1Tris -HCl，0.025% Triton X-100，1% DMSO組成(pH=9.0)。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sequential injection microfluidic chemiluminescence systemPump:PHD -2000 micropump;PMT:photo multiplier tube;SP:syringe pump;SV:six-port multiposition valve.

1.2 孵育DNA酶

1.5 μmol·L-1的寡核苷酸溶液于溫度90 ℃加熱5 min，緩慢冷卻至室溫。然后加入等體積不同濃度的KCl，室溫孵育1 h；再向溶液中加入等體積的1.5 μmol·L-1血紅素，室溫孵育30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。通過PHD -2000微量注射泵以150 μL·min-1的速度將0.5 mmol·L-1的魯米諾和0.7 mol·L-1H2O2分別從微流控芯片的1、2口推入，待基線平穩(wěn)后，SV先轉(zhuǎn)到C口吸取18 μL反應(yīng)緩沖液，再轉(zhuǎn)到D口吸取2 μL DNA酶試樣溶液，然后轉(zhuǎn)到A口，將20 μL溶液通過3口注入，在第二個(gè)螺旋通道內(nèi)與魯米諾-H2O2發(fā)光試劑反應(yīng)并由PMT檢測。除第二個(gè)螺旋通道外，其余非檢測區(qū)域均用黑膠帶覆蓋；整個(gè)微芯片置于暗盒中。重復(fù)上述過程檢測E、F處不同試樣DNA酶溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

常溫下，富含鳥嘌呤的寡核苷酸PS5. M以自由無序狀態(tài)存在溶液中；加入K+后，PS5. M的構(gòu)象發(fā)生變化，以Hoogsteen堿基配對方式形成G -四分體平面，繼而堆積成G -四聯(lián)體；而G -四聯(lián)體與血紅素有較高的親合力，相互結(jié)合后形成DNA酶。DNA酶具有類辣根過氧化物酶活性，可以催化H2O2氧化魯米諾(圖2)。實(shí)驗(yàn)表明，DNA酶的催化活性與K+濃度相關(guān)，即化學(xué)發(fā)光信號可隨K+濃度增大而增強(qiáng)。而當(dāng)溶液中無K+加入時(shí)，自由無序狀態(tài)的PS5. M無法有效地與血紅素親合，僅產(chǎn)生微弱的化學(xué)發(fā)光。據(jù)此，可以根據(jù)化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度定量測定K+。

圖2 DNA酶增敏化學(xué)發(fā)光法分析測定K+示意圖Fig.2 Schematic diagram of chemiluminescence(CL) determination of K+ enhanced by K+-induced DNAzyme

圖3 血紅素與寡核苷酸發(fā)生親合作用前后的紫外-可見吸收光譜Fig.3 UV-Vis absorption spectra of hemin -oligonucleotide interactions in the absence or presence of K+Hemin:0.5 μmol·L-1;PS5. M:0.5 μmol·L-1;PS2. M:0.5 μmol·L-1;K+:400 μmol·L-1.

2.2 DNA酶的表征和催化活性

血紅素分子內(nèi)的卟啉環(huán)在400 nm 波長附近具有較強(qiáng)的B帶紫外-可見吸收，稱為Soret 帶；當(dāng)血紅素與G -四聯(lián)體分子親合后，該Soret帶的最大吸收峰會發(fā)生增色和紅移的現(xiàn)象[12,13]。為研究PS5. M與血紅素的親合效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)比較了血紅素與PS5. M親合前后的吸收光譜圖，并進(jìn)一步以PS2. M為參照物，對照比較了血紅素與PS2. M結(jié)合前后的吸收光譜。由圖3可見，血紅素的特征吸收波長為398 nm(曲線a);在K+參與下，血紅素與PS5. M的親合效應(yīng)顯現(xiàn)，最大吸收波長紅移到404 nm，且吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(曲線e)。這與文獻(xiàn)報(bào)道的G -四聯(lián)體與血紅素親合作用結(jié)果一致[12,13]，說明K+可促進(jìn)PS5. M形成G -四聯(lián)體，并與血紅素結(jié)合形成DNA酶。而在相同的條件下，PS2. M與血紅素結(jié)合后引起的增色效應(yīng)明顯較弱(曲線d)。因此，推測PS2. M形成的G -四聯(lián)體與血紅素的親合作用小于PS5. M。另外，當(dāng)溶液中無K+時(shí)，血紅素與PS2. M以及PS5. M的親合作用均不能引起Soret帶的明顯變化(曲線b、c)。證明K+不存在時(shí)，PS5. M和PS2. M均難以形成G -四聯(lián)體，自由無序狀態(tài)的寡核苷酸鏈也難以與血紅素親合。

為考察PS5. M形成的DNA酶的活性，并與PS2. M形成的DNA酶比較，實(shí)驗(yàn)中將上述兩種酶(均為0.5 μmol·L-1)，分別用于催化魯米諾(0.5 mmol·L-1)-H2O2(0.7 mol·L-1)發(fā)光反應(yīng)。結(jié)果顯示，PS5. M形成的DNA酶催化增敏效應(yīng)幾乎是PS2. M形成的DNA酶的增敏效應(yīng)的一倍。表明K+誘導(dǎo)PS5.M形成的DNA酶具有更高的催化活性。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

由于G -四聯(lián)體與血紅素的親合反應(yīng)條件與DNA酶的形成密切相關(guān)，且化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件對于提高檢測的靈敏度有較大影響。因此，實(shí)驗(yàn)有針對性地優(yōu)化了G -四聯(lián)體與血紅素親合反應(yīng)的條件，以及DNA酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的條件。

2.3.1溫度對DNA酶形成的影響考察了4～60 ℃溫度范圍內(nèi)，不同的孵育溫度對G -四聯(lián)體和血紅素親合作用的影響。從圖4可以看出，孵育溫度從4 ℃升高至25 ℃，DNA酶的催化增敏效應(yīng)增強(qiáng)；但繼續(xù)升高溫度，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度卻逐漸下降；這可能與G -四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。因?yàn)樵谶^高溫度下，通過Hoogsteen堿基配對的G -四聯(lián)體分子，會出現(xiàn)氫鍵打開呈自由無序單鏈的現(xiàn)象。因此，提高溫度雖有利于親合反應(yīng)的較快進(jìn)行，但同時(shí)控制較適當(dāng)?shù)臏囟纫才c保持G -四聯(lián)體分子的穩(wěn)定密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中最終選擇25 ℃作為G -四聯(lián)體/血紅素親合反應(yīng)的孵育溫度。

2.3.2反應(yīng)時(shí)間對DNA酶形成的影響考察了10～90 min 范圍內(nèi)，G -四聯(lián)體與血紅素親合反應(yīng)時(shí)間對DNA酶形成活性的影響。結(jié)果表明，反應(yīng)時(shí)間從10 min 延長至30 min，DNA酶催化增敏效應(yīng)有明顯增加，但反應(yīng)時(shí)間達(dá)30 min后，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度則趨于穩(wěn)定。因此，最終選擇30 min 為G -四聯(lián)體與血紅素親合反應(yīng)的時(shí)間。

2.3.3發(fā)光試劑濃度對催化發(fā)光的影響根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，在DNA酶催化氧化反應(yīng)中，發(fā)光底物濃度對信號的影響遠(yuǎn)比氧化劑(H2O2)濃度的影響小。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)論，即控制H2O2濃度在0.3 mol·L-1，魯米諾濃度從0.25 mmol·L-1升高至1 mmol·L-1，DNA酶催化發(fā)光強(qiáng)度變化不明顯；反之，若控制魯米諾濃度為0.5 mmol·L-1，考察H2O2濃度從0.1 mol·L-1升高至0.7 mol·L-1，化學(xué)發(fā)光顯著增強(qiáng)(圖5)；而當(dāng)H2O2濃度大于0.7 mol·L-1后，發(fā)光又逐漸減弱。因此，最終選擇0.5 mmol·L-1魯米諾，0.7 mol·L-1H2O2作為發(fā)光試劑的濃度條件。

2.3.4試劑流速對催化發(fā)光的影響實(shí)驗(yàn)考察了試劑(魯米諾和H2O2)流速對發(fā)光信號的影響。結(jié)果表明，當(dāng)流速從30 μL·min-1開始升高時(shí)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨流速增大而增強(qiáng)，并在150 μL·min-1時(shí)發(fā)光強(qiáng)度最大；繼續(xù)增大流速至180 μL·min-1，發(fā)光強(qiáng)度又降低。因此，試劑流速選擇150 μL·min-1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DNA酶催化的魯米諾-H2O2發(fā)光反應(yīng)速度較快。

2.4 方法的選擇性

圖4 溫度對G -四聯(lián)體與血紅素結(jié)合形成DNA酶的影響Fig.4 Effect of temperature on formation of DNAzyme by G -quadruplex and heminPS5. M:0.5 μmol·L-1;K+:100 μmol·L-1;Hemin:0.5 μmol·L-1;H2O2:0.7 mol·L-1;Luminol:0.5 mmol·L-1.

圖5 H2O2濃度對化學(xué)發(fā)光的影響Fig.5 Effect of concentration of H2O2 on chemiluminescencePS5. M:0.5 μmol·L-1;K+:100 μmol·L-1;Hemin:0.5 μmol·L-1;Luminol:0.5 mmol·L-1.

2.5 線性范圍、檢出限和精密度

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，K+在1.0～700 μmol·L-1范圍內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度線性相關(guān)，線性回歸方程為：△I=1.988c(μmol·L-1)+20.086(△I為扣除空白信號的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度)，相關(guān)系數(shù)為0.991，其檢出限(S/N=3)為0.54 μmol·L-1。同時(shí)，對100 μmol·L-1的K+形成的DNA酶平行測定10次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.61%。發(fā)光檢測通量為60 h-1。

2.6 實(shí)際水樣分析

取浙江大學(xué)啟真湖不同湖段的湖水，用0.22 μm的混合纖維素微孔濾膜過濾，水樣稀釋一倍，按照實(shí)驗(yàn)方法孵育DNA酶并分析K+含量,并與原子吸收法(AAS)結(jié)果對照。結(jié)果如表1所示，可見分析結(jié)果與原子吸收測定結(jié)果基本一致，進(jìn)一步用加入回收法檢驗(yàn)方法準(zhǔn)確性，回收率93.3%～108.6%。表明本方法可用于實(shí)際水樣中K+的分析。

表1 水樣中K+的分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究利用K+促進(jìn)DNA酶形成，進(jìn)而催化魯米諾-H2O2化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的原理，建立了微流控順序注射化學(xué)發(fā)光聯(lián)用檢測K+的新方法。該方法儀器裝置簡單，試劑消耗大幅度減小，檢測連續(xù)、快速。對真實(shí)水樣中K+的測定結(jié)果與火焰原子吸收測定結(jié)果相符，加標(biāo)回收率為93.3%～108.6%。建立的方法對檢測K+具有高選擇性，有望應(yīng)用于環(huán)境樣品和生物樣品中K+的測定。