馮家豪　楊偉金　孫政

[摘要] 目的 探討TWS119對(duì)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞系的耐藥性和增殖能力的影響。 方法 將LOVO細(xì)胞系分成3組，分別為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，TWS119處理組加入2、1 μmol/L的TWS119，對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行Western blot和qRT-PCR檢測(cè)β-鏈蛋白（β-catenin）多藥耐藥相關(guān)蛋白1 （MRP1）及P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)，用流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞周期，用CCK8檢測(cè)細(xì)胞耐藥性變化。 結(jié)果 與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中MRP1、P-gp的mRNA和β-catenin、MRP1、P-gp的蛋白表達(dá)，G2/M期細(xì)胞比例均明顯升高（P < 0.05）。雖然1 μmol/L TWS119處理組在5、10 μmol/L5-氟尿嘧啶（5-Fu）作用下存活率無(wú)明顯變化（P > 0.05），但2 μmol/L TWS119處理組存活率明顯升高（P < 0.05）；而且在15 μmol/L 5-FU作用下處理組存活率明顯升高（P < 0.05）。 結(jié)論 在體外實(shí)驗(yàn)中，TWS119可以通過(guò)上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的耐藥性和增殖能力，揭示癌細(xì)胞耐藥性、Wnt/β-catenin通路和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體如P-gp、MRP1等存在聯(lián)系。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)直腸癌；化療耐藥；TWS119；Wnt/β-catenin信號(hào)通路

[中圖分類(lèi)號(hào)] R73-36 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2015）09（a）-0027-05

[Abstract] Objective To discuss the impact of TWS119 on chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell line LOVO. Methods The cell line LOVO was divided into three group， 2 μmol/L TWS119 treatment group， 1 μmol/L TWS119 treatment group and negative control group， the TWS119 treatment groups were added 2， 1 μmol/L TWS119， the negative control group was added equal volume of DMSO， Western blot and qRT-PCR were performed to test the expression of P-gp， β-catenin and MRP1 after 24 h treatment. Flow cytometry and CCK8 test were performed to analyze the cells tolerance change. Results Compared with the negative control group， the mRNA expression of MRP1， P-gp， the protein expression of P-gp， β-catenin and MRP1， the G2/M period cell rate in 2 μmol/L TWS119 treatment group and 1 μmol/L TWS119 treatment group significantly increased （P < 0.05）； the survival rate with 5， 10 μmol/L 5-FU treatment had no significantly changed in 1 μmol/L TWS119 treatment group （P > 0.05）， while those in 2 μmol/L treatment group significantly increased （P < 0.05）， and the survival rate of both treatment group significantly increased with 15 μmol/L 5-FU treatment （P < 0.05）. Conclusion TWS119 can improve the chemotherapy drug resistance and proliferation capacity of colon cancer cell through increasing Wnt/β-catenin signaling pathway in vitro， these phenomena perhaps reveals there are some relationships among drug resistance of cancer cell， Wnt/β-catenin signaling pathway and the ABC transporter such as MRP1 and P-gp.

[Key words] Colorectal cancer； Chemotherapy resistance； TWS119； Wnt/β-catenin

在各種癌癥中，全球結(jié)直腸癌患病率居第3位，僅次于肺癌和乳腺癌[1]。東亞結(jié)直腸癌發(fā)病率正在上升，可能與生活方式西方化、高脂低纖維飲食、肥胖和吸煙的流行有關(guān)[2]。大部分新發(fā)案例可以接受根治性手術(shù)[3]，但對(duì)于Ⅲ期結(jié)直腸癌患者，術(shù)后仍需化療[4]；而且20%～30%新發(fā)病例有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這些患者即使進(jìn)行根治性手術(shù)，仍有近50%的患者發(fā)生局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5]，對(duì)于這部分患者，系統(tǒng)化療顯得更為重要[4，6]。但單純化療并非根治手段，由于隨著治療的進(jìn)展，癌癥耐藥性會(huì)逐步增強(qiáng)，這與患者藥代動(dòng)力學(xué)、藥物和腫瘤類(lèi)型、耐藥機(jī)制、腫瘤微環(huán)境有關(guān)，機(jī)制非常復(fù)雜[7]。Wnt（wingless integration）信號(hào)通路被證實(shí)與人類(lèi)癌癥有關(guān)[8]，分為Wnt/β-catenin（cadherin-associated protein，β-鏈蛋白，β-1）通路、Wnt/Ca2+通路和WNT/PCP（planar cell polarity）通路[9]。有研究顯示，相關(guān)基因突變導(dǎo)致的Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控失調(diào)出現(xiàn)在大部分結(jié)直腸癌病例中[10]。Wnt/β-catenin可以調(diào)節(jié)c-myc和cyclin D1基因，它們?cè)诩?xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化中起重要作用，在結(jié)腸癌中這些基因常常被異常激活[11]。TWS119是一種人工合成的小分子化合物，它可以促進(jìn)老鼠胚胎腺癌細(xì)胞和胚胎癌細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，而且發(fā)現(xiàn)其作用機(jī)制為抑制糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3 beta，GSK-3β）的磷酸化作用，可使胞內(nèi)β-catenin濃度升高進(jìn)而上調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性[12]。但TWS119對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的作用仍未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究TWS119對(duì)LOVO細(xì)胞系的耐藥性和增殖性影響，探討其對(duì)人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞的影響作用，進(jìn)一步揭示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路與人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

LOVO細(xì)胞系（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）分為2 μmol/L TWS119處理組、1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組。在含10%胎牛血清、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco），5%CO2、37℃無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，TWS119（Selleck）溶于DMSO中-20℃避光保存，處理組分別加入2、1 μmol/L TWS119[13]，陰性對(duì)照組加入等體積DMSO，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 qRT-PCR

收集細(xì)胞，用trizol試劑（invitrogen）提取細(xì)胞總RNA，用兩步法qRT-PCR SYBER試劑盒（TAKARA）檢測(cè)各組細(xì)胞MRP1、P-gp mRNA表達(dá)，各引物設(shè)3個(gè)復(fù)孔，引物序列（由Invitrogen公司合成）見(jiàn)表1。

1.3 Western blot

收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后一抗孵育過(guò)夜，二抗孵育1 h，曝光后掃描，使用Image J軟件分析灰度值。一抗、二抗均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 CCK8

調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接種于96孔板，5-氟尿嘧啶（5-FU）設(shè)5、10、15 μmol/L 3個(gè)濃度梯度，陰性對(duì)照加等體積培養(yǎng)基，各設(shè)5個(gè)復(fù)孔，無(wú)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μL CCK8試劑（碧云天）作用4 h后酶標(biāo)儀分析吸光度，每組重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞分析

收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌離心后用75%酒精固定過(guò)夜，碘化丙啶試劑（碧云天）染色30 min，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組qRT-PCR結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中P糖蛋白（P-gp）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1）mRNA表達(dá)量顯著增加（P < 0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組P-gp和MRP1 mRNA表達(dá)量顯著增加（P < 0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

2.2 三組Western blot結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，2 μmol/L TWS119處理組和1 μmol/L TWS119處理組細(xì)胞中β-鏈蛋白（β-catenin）、P-gp和MRP1蛋白表達(dá)量顯著增加（P < 0.05），且2 μmol/L TWS119處理組較1 μmol/L TWS119處理組β-cateniu、P-gp和MRP1蛋白表達(dá)量顯著增加（P < 0.05）。見(jiàn)圖2、3。

2.3 三組細(xì)胞在不同濃度5-FU作用下CCK8試驗(yàn)結(jié)果

在5 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。在10 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；但1 μmol/L TWS119處理組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。在15 μmol/L 5-FU作用下，2 μmol/L TWS119處理組LOVO細(xì)胞存活率高于1 μmol/L TWS119處理組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；1 μmol/L TWS119處理組存活率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表3、圖4。

2.4 TWS119對(duì)增殖細(xì)胞比例的影響

陰性對(duì)照組G2/M期細(xì)胞比例為（6.42±2.62）%、2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例為（17.8±1.60）%、1 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例為（11.63±1.59）%。與陰性對(duì)照組比較，2、1 μmol/L TWS119處理組中G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；且2 μmol/L TWS119處理組G2/M期細(xì)胞比例明顯高于1 μmol/L TWS119處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

通常情況下在細(xì)胞內(nèi)由軸抑制蛋白（axis inhibition protein，Axin）、結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白（adenomatous polyposis coli，APC）、酪蛋白激酶1（casein kinase 1）和GSK-3β組成的復(fù)合體對(duì)β-catenin有磷酸化作用，磷酸化的β-catenin隨后被泛素-蛋白酶體降解，但Wnt與胞膜上的卷曲蛋白受體（frizzled class receptor）和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（low density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）結(jié)合后，通過(guò)蓬亂蛋白（dishevelled segment polarity protein，DVL）使上述蛋白復(fù)合體受到抑制，β-catenin在胞內(nèi)得以集聚，濃度升高。β-catenin通過(guò)核孔進(jìn)入細(xì)胞核，可以與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子家族（T-cell factor/lymphoid enhancer-binding factor，TCF/LEF）、環(huán)腺苷酸效應(yīng)元件結(jié)合蛋白結(jié)合蛋白[cAMP response element-binding protein （CREB）-binding protein，CBP]等結(jié)合，促進(jìn)多種轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[14-16]。

P-gp和MRP1同屬ATP結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)運(yùn)體（ATP binding cassette transporter，ABC transporter）家族成員。P-gp由ABCB1基因編碼，在胞膜上有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點(diǎn)，可以水解ATP釋放能量引起構(gòu)象改變，進(jìn)而使底物排出細(xì)胞[17]。P-gp被證實(shí)與腫瘤耐藥性有關(guān)，使癌細(xì)胞抵抗蒽環(huán)類(lèi)、長(zhǎng)春堿類(lèi)和紫杉醇等化療藥的毒性[18]。MRP1是從P-gp表達(dá)缺失的耐藥細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的，由ABCC1基因編碼，與P-gp類(lèi)似的是，MRP1也有跨膜區(qū)-ATP結(jié)合位點(diǎn)這種功能性結(jié)構(gòu)[19]。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等疾病中，MRP1過(guò)表達(dá)是化療效果不佳的預(yù)示性指標(biāo)[20]。

本研究結(jié)果表明TWS119可使人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞系β-catenin、P-gp和MRP1表達(dá)上調(diào)，明顯提高細(xì)胞的增殖活性和5-FU耐藥性，且存在劑量依賴(lài)性。該機(jī)制可能是TWS119選擇性抑制GSK-3β磷酸化活性，導(dǎo)致β-catenin在胞內(nèi)濃度上升而使β- catenin/TCF轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，其下游基因c-myc和cyclin-D1表達(dá)增加均可增強(qiáng)LOVO細(xì)胞增殖活性，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能與ABCB1和ABCC1兩個(gè)基因表達(dá)有關(guān)，致使P-gp和MRP1表達(dá)增加，對(duì)5-Fu的外排作用增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞耐藥性增加。

1 μmol/L TWS119處理組雖然有P-gp和MRP1的表達(dá)上調(diào)，但5、10 μmol/L 5-FU作用下耐藥性較陰性對(duì)照組無(wú)明顯增加，可能是由于胞內(nèi)P-gp和MRP1表達(dá)需提高至一定水平才能顯著影響LOVO細(xì)胞5-FU耐藥性；在15 μmol/L 5FU作用下1 μmol/L TWS119處理組也有顯著耐藥性，可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜?-FU濃度較高時(shí)，P-gp和MRP1的外排泵效率也相應(yīng)提高。

本研究揭示癌細(xì)胞耐藥可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，希望可以為癌細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究提供思路。此外，TWS119在人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞系中能影響信號(hào)通路的活性，可以用于信號(hào)通路的相關(guān)研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide： sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 [J]. Int J Cancer，2015，5（136）：e359-e386.

[2] Center MM，Jemal A，Ward E. International trends in colorectal cancer incidence rates [J]. Cancer Epidemiol Bio-markers Prev，2009，18（6）：1688-1694.

[3] Lombardi L，Morelli F，Cinieri S，et al. Adjuvant colon cancer chemotherapy：where we are and where we'll go [J]. Cancer Treat Rev，2010，36（suppl 3）：s34-s41.

[4] Engstrom PF，Arnoletti JP，Benson AB，et al. NCCN clinical practice guidelines in oncology：colon cancer [J].J Natl Compr Canc Netw，2009，7（8）：778-831.

[5] Gill S，Blackstock AW，Goldberg RM. Colorectal cancer [J]. Mayo Clin Proc，2007，82（1）：114-129.

[6] Scheithauer W，Rosen H，Kornek GV，et al. Randomised comparison of combination chemotherapy plus supportive care with supportive care alone in patients with metastatic colorectal cancer [J]. BMJ，1993，306（6880）：752-755.

[7] Foo J，Michor F. Evolution of acquired resistance to anti-cancer therapy [J]. J Theor Biol，2014， 355：10-20.

[8] Polakis P. Wnt signaling in cancer [J]. Cold Spring Harb Perspect Biol，2012，4（5）：a008052.

[9] Van Camp JK，Beckers S，Zegers D，et al. Wnt signaling and the control of human stem cell fate [J]. Stem Cell Rev，2014，10（2）：207-229.

[10] Clevers H. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease [J]. Cell，2006，127（3）：469-480.

[11] Uematsu K，Kanazawa S，You L，et al. Wnt pathway activation inmesothelioma： evidence of Dishevelled overexpression and transcriptional activity of beta-catenin [J]. Cancer Research，2003，63（15）：4547-4551.

[12] Ding S，Schultz PG. A role for chemistry in stem cell biology [J]. Nat Biotechnol，2004，22（7）：833-840.

[13] Ding S，Wu TY，Brinker A，et al. Synthetic small molecules that control stem cell fate [J]. Proc Natl Acad Sci USA，2003， 100（13）：7632-7637.

[14] Archbold HC，Yang YX，Chen L，et al. How do they do Wnt they do： regulation of transcription by the Wnt/beta-catenin pathway [J]. Acta Physiologica（Oxford），2012，204（1）：74-109.

[15] Teo JL，Kahn M. The Wnt signaling pathway in cellular proliferation and differentiation：a tale of two coactivators [J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2010，62（12）：1149-1155.

[16] Sustmann C，F(xiàn)lach H，Ebert H，et al. Cell-type-specific function of BCL9 involves a transcriptional activation domain that synergizes with beta-catenin [J]. Molecular and Cellular Biology，2008，28（10）：3526-3537.

[17] Sauna ZE，Smith MM，Müller M，et al. The mechanism of action of multidrug-resistance-linked p-glycoprotein [J]. J Bioenerg Biomembr，2001，33 （6）：481-491.

[18] Avendano C，Menendez JC. Inhibitors of multidrug resisitance to antitumor agents （ADR） [J]. Curr Med Chem，2002，9（2）：159-193.

[19] Borst P，Evers R，Kool M，et al. A family of drug transporters： the multidrug resistance-associated proteins [J].J Natl Cancer Inst，2000，92（16）：1295-1302.

[20] Deeley RG，Westlake C，Cole SP. Transmembrane transport of endo- and xenobiotics by mammalian ATP-binding cassette multidrug resistance proteins [J]. Physiol Rev，2006，86（3）：849-899.

（收稿日期：2015-04-08 本文編輯：蘇 暢）