陳建萍　王萍　楊庚萍　歐陽少波　黃自坤

（1江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)人民醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337055；2江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)中醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337016；3南昌大學附屬口腔醫(yī)院修復科江西南昌330006；4南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科江西南昌330006）

MicroRNA-21調控口腔鱗癌細胞順鉑耐藥及其作用機制

陳建萍1王萍2楊庚萍2歐陽少波3黃自坤4

（1江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)人民醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337055；2江西省萍鄉(xiāng)市湘東區(qū)中醫(yī)院口腔科萍鄉(xiāng)337016；3南昌大學附屬口腔醫(yī)院修復科江西南昌330006；4南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科江西南昌330006）

目的：探討microRNA-21（miRNA-21）在人口腔鱗癌順鉑耐藥細胞中的表達及其作用機制。方法：采用實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測miRNA-21在口腔鱗癌細胞株Tca8113及順鉑耐藥細胞株Tca8113/DDP的表達；采用體外轉染法將miRNA-21模擬物（mimics）或抑制物（inhibitor）分別轉染Tca8113和Tca8113/DDP細胞，采用RT-PCR檢測轉染前后細胞中miRNA-21的表達情況；采用CCK8實驗檢測轉染前后細胞對順鉑敏感性的變化；并用Western blot檢測轉染前后細胞中PTEN的表達變化。采用雙熒光素酶報告基因驗證miRNA-21是否作用于PTEN基因的3'-UTR區(qū)預測靶位。結果：miRNA-21在Tca8113/DDP細胞中的表達水平是Tca8113細胞的（8.26±1.37）倍（P＜0.01）。Tca8113細胞轉染miRNA-21 mimics后，細胞中miRNA-21表達水平是轉染前的（10.51±2.18）倍（P＜0.01），順鉑對Tca8113細胞增殖的抑制率較轉染前明顯下降（P＜0.05），細胞內PTEN表達水平較轉染前明顯下降（P＜0.05）。Tca8113/DDP細胞在轉染miRNA-21 inhibitor后，細胞中miRNA-21表達水平是轉染前的（0.32±0.14）倍（P＜0.01），順鉑對Tca8113/DDP細胞增殖的抑制率與轉染前比較明顯增加（P＜0.05），細胞內PTEN表達水平較轉染前明顯增高（P＜0.05）。經(jīng)雙熒光素酶報告基因驗證PTEN是miRNA-21的靶基因。結論：miRNA-21在口腔鱗癌順鉑耐藥細胞Tca8113/DDP中異常高表達，下調其表達可部分逆轉細胞耐藥性，miRNA-21可能通過作用于PTEN參與口腔鱗癌細胞順鉑耐藥的發(fā)生和發(fā)展。

口腔鱗癌；微小RNA-21；順鉑；耐藥；人第10號染色體缺失的磷酸酶

口腔鱗癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率有逐年增高的趨勢［1］。盡管近年來新的抗腫瘤藥物不斷出現(xiàn)，多數(shù)患者仍不能夠獲得有效地控制，這其中一個重要原因是口腔鱗癌細胞對化療藥物產生了耐藥［2］。因此研究口腔鱗癌耐藥性產生的機制及尋找逆轉耐藥的途徑是目前亟待解決的問題。

MicroRNA（miRNA）是一種內源性的非編碼的RNA序列，一般由21～23個核苷酸組成小RNA分子，廣泛存在于各種生物體中，可在轉錄后水平負性調控基因的表達，miRNA不僅參與細胞增殖、分化、凋亡、周期調控等，對腫瘤的化療耐藥也具有重要作用［3～4］。而在業(yè)已發(fā)現(xiàn)的眾多miRNA中，miRNA-21被認為是調控腫瘤惡性生物學行為的重要基因之一，而且還參與調控腫瘤細胞的多重耐藥，下調miRNA-21可明顯增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性［5～7］。但是miRNA-21是否參與了口腔鱗癌細胞順鉑耐藥的調節(jié)及其調控機制如何，目前尚未有相關文獻報道。本研究以順鉑敏感口腔鱗癌親本細胞株Tca8113及順鉑耐藥細胞株Tca8113/DDP為細胞模型，探討miRNA-21是否參與調節(jié)口腔鱗癌順鉑耐藥及其可能的分子機制，為臨床口腔鱗癌化療藥物耐藥的防治提供新的治療策略。

1　材料與方法

1.1主要試劑口腔鱗癌親本細胞株Tca8113和耐順鉑細胞株Tca8113/DDP均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。RPMI 1640及胎牛血清購自美國Gibco公司；順鉑購自美國Sigma公司；蛋白裂解液RIPA購自碧云天公司；β-actin抗體和兔抗人PTEN單抗購自美國Abcam公司，HRP標記的二抗購于Sigma公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司。Lipofectamine2000 Transfection Reagent購自Life Technologies公司；Prime-scriptTM逆轉錄試劑盒和miRNA定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；CCK-8試劑盒購自南京凱基生物科技公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和pGL載體購于美國Promega公司。miRNA-21 mimics、miRNA-21 inhibitor及相應對照均由上海GenePharma公司合成。

1.2細胞培養(yǎng)親本細胞株Tca8113和耐順鉑細胞株Tca8113/DDP分別于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。向Tca8113/DDP細胞培養(yǎng)液中將加入終濃度為5 μmol/L的順鉑以維持細胞耐藥性。

1.3細胞轉染實驗設置空白對照組、陰性對照組（僅含無義序列）和實驗組（miRNA-21 mimics或miRNA-21 inhibitor）。取對數(shù)生長期細胞進行細胞轉染，細胞轉染按照Lipofectmine 2000試劑盒說明書操作，將10 nmol/L miRNA-21 mimics或miRNA-21 inhibitor分別轉染至Tca8113和Tca8113/DDP細胞中。

1.4實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測miRNA-

21的表達用Trizol試劑提取對數(shù)生長期的細胞總RNA，使用分光光度計測定提取的RNA吸收值，并計算RNA濃度。按照TaKaRa公司的Prime-scriptTM逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄成cDNA，反應條件：30℃8 min，40℃25 min，-80℃保存?zhèn)溆谩T-PCR按照SYBR Green說明書配制反應體系（25 μl體系）。以U6作為miRNA-21內參。取cDNA進行RT-PCR，定量PCR條件如下：95℃預變性10 s，然后進行40個循環(huán)；95℃8 s，65℃10 s，然后70℃延伸10 s，繪制擴增曲線，反應結束后得到各反應管循環(huán)閾值（Ct），miRNA-21的相對表達量采用2-ΔΔCt法對基因表達量進行相對定量。1.5CCK8檢測轉染前后細胞對順鉑敏感性變化按照CCK8試劑盒說明書進行實驗。轉染24 h后，取對數(shù)期Tca8113或Tca8113/DDP細胞進行消化及收集，以5×103個細胞接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔接種體積為100 μl，并設僅含培養(yǎng)基的空白對照。細胞貼壁后，分別加入不同濃度的順鉑，每孔加入100 μl。細胞培養(yǎng)48 h后，每孔CCK8與培養(yǎng)液以1∶10加入，繼續(xù)孵育2 h，在酶標儀上采用450 nm波長測量每孔吸光度（Optical Density，OD）值。根據(jù)數(shù)據(jù)繪制細胞生長抑制率曲線，并計算順鉑對細胞的半數(shù)抑制濃度（half Inhibition Concentration，IC50）。抑制率計算公式為：生長抑制率=（1-OD用藥組/OD對照組）×100%，以最小二乘法進行曲線擬合，得到IC50值，實驗重復3次。

1.6Western blot檢測細胞中PTEN的含量收集轉染前后細胞，PBS洗滌2次，RIPA裂解液提取細胞總蛋白，加SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5 min離心，并用BCA法測定蛋白含量。按每孔20 μl上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜1 h至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。分別加入兔抗人PTEN抗體（1∶2 000）、鼠抗人β-actin抗體（1∶500），4℃孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，分別加入HRP標記的羊抗兔二抗（1∶1 000）和羊抗鼠二抗（1∶4 000），室溫孵育1 h洗膜，加入ECL發(fā)光液顯影，用Image J圖像分析系統(tǒng)掃描圖像的光密度，以各組目的蛋白條帶光密度值與β-actin光密度值計算相對比值。

1.7雙熒光素酶報告基因檢測化學合成包含有與相應miRNA-21互補結合的靶基因PTEN 3' -UTR序列片段和突變的PTEN 3'-UTR序列片段，將包含預測miRNA-21結合位點的PTEN 3'-UTR和突變的PTEN 3'-UTR（mutant）的片段克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點中。正常培養(yǎng)的Tca8113細胞，以4×105個/ml均勻接種于6孔培養(yǎng)板，每孔體積1 ml。共轉染包含PTEN 3' -UTR或突變的PTEN 3'-UTR（mutant）的熒光素酶質粒，以及miRNA-21 mimics或miRNA-21 mimics control。轉染48 h后收集細胞，按照Promega提供的方法進行雙熒光素酶活性檢測。

1.8統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間分析用單因素方差分析，當P＜0.05時表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1耐藥細胞株與親本細胞株對順鉑的敏感性經(jīng)不同濃度的順鉑作用48 h后，Tca8113/DDP及Tca8113兩株細胞的存活率不同；Tca8113/DDP及Tca8113對DDP的IC50分別為（22.37±3.55）μmol/L、（0.82±0.16）μmol/L（P＜0.01），前者是后者的27.28倍。

2.2耐藥細胞株與親本細胞株miRNA-21的表達RT-PCR檢測結果顯示，miRNA-21在耐藥細胞株Tca8113/DDP中的表達水平顯著升高，與口腔鱗癌親本細胞株Tca8113相比，表達升高（8.26±1.37）倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.3轉染miR-21 mimics或inhibitor后miRNA-21表達變化Tca8113細胞轉染miRNA-21 mimics后，細胞中miRNA-21表達水平明顯增高，是轉染前的（10.51±2.18）倍（P＜0.01）。而Tca8113/DDP細胞在轉染miRNA-21 inhibitor后，細胞中miRNA-21表達水平明顯下降，是轉染前的（0.32±0.14）倍（P＜0.01）。

2.4轉染miR-21 mimics或inhibitor后口腔鱗癌細胞對順鉑敏感性變化我們進一步檢測了miRNA-21改變異常是否能夠影響口腔鱗癌細胞對順鉑敏感性。在Tca8113細胞中分別轉染miRNA-21mimics和mimicscontrol，在Tca8113/DDP細胞中分別轉染miRNA-21 inhibitor和inhibitor control。CCK8結果顯示，轉染miRNA-21 mimics后Tca8113細胞存活率隨順鉑濃度的增加明顯升高，順鉑對細胞增殖的抑制率較轉染前明顯下降，轉染miRNA-21 mimics前順鉑對Tca8113細胞的IC50為（0.78±0.11）μmol/L；轉染miRNA-21 mimics后順鉑對Tca8113細胞的IC50為（1.64±0.18）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1A。Tca8113/DDP細胞轉染miRNA-21 inhibitor后，順鉑對其增殖的抑制率與轉染前比較明顯增加，轉染miRNA-21 inhibitor前順鉑對Tca8113/DDP細胞的IC50為（26.56±4.67）μmol/L；轉染miRNA-21 inhibitor后順鉑對Tca8113/DDP細胞的IC50為（8.17±2.05）μmol/L，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1B。

圖1　Tca8113細胞和Tca8113/DDP細胞分別轉染miRNA-21 mimics和miRNA-21 inhibitor后順鉑對細胞的抑制率變化

2.5口腔鱗癌細胞中PTEN是miRNA-21調節(jié)的下游靶基因為了確定miRNA-21在口腔鱗癌細胞中調節(jié)的下游靶基因，我們利用在線生物信息學軟件miRanda預測發(fā)現(xiàn)PTEN的mRNA的3'-UTR含有能和miRNA-21成熟序列結合的位點，提示PTEN可能是miRNA-21的靶基因。為了進一步證實miRNA-21對口腔鱗癌細胞PTEN表達的調節(jié)，我們檢測了口腔鱗癌細胞中miRNA-21和PTEN表達水平之間的關系。Western blot檢測結果顯示，在Tca8113細胞中轉染miRNA-21 mimics增加miRNA-21的表達水平后，細胞內PTEN表達水平明顯下降，與mimics陰性對照組和空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在Tca8113/DDP細胞中轉染miRNA-21 inhibitor降低miRNA-21的表達水平后，細胞內PTEN表達水平明顯升高，與inhibitor陰性對照組和空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2A。這一結果表明miRNA-21抑制了口腔鱗癌細胞中PTEN的表達。

為了進一步明確miRNA-21通過與3'-UTR結合調節(jié)PTEN表達，我們構建了含有PTEN的3' -UTR序列的熒光素酶報告基因表達載體WT-PTEN，同時構建了PTEN 3'-UTR區(qū)miRNA-21結合種子序列突變的載體Mut-PTEN。見圖2B。Tca8113細胞中，表達野生型PTEN的3' -UTR序列的細胞中，轉染miRNA-21 mimics上調miRNA-21的水平與轉染miRNA對照組相比熒光素酶活性明顯下降（P＜0.01），說明miRNA-21抑制了熒光素酶的表達。轉染突變型PTEN的3'-UTR序列的細胞中，miRNA-21 mimics上調miRNA-21的水平與對照組相比熒光素酶活性無明顯差異（P＞0.05），說明與miRNA-21是通過打靶并結合PTEN的3'-UTR來調節(jié)蛋白表達的。見圖2C。

圖2　PTEN為miRNA-21靶基因

3　討論

miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的小型非編碼RNA，可特異性識別靶mRNA的3'-UTR并與之結合，促進靶mRNA的降解和（或）翻譯抑制而發(fā)揮負調控基因表達的作用。近年來，大量研究表明miRNA可以調控腫瘤增殖、凋亡及耐藥相關靶基因的表達，在腫瘤耐藥過程中發(fā)揮著至關重要的作用［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-21參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展的調節(jié)。如，在乳腺癌、結直腸癌和肺癌的腫瘤組織中，miRNA-21表達明顯上調［9］。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-21在腫瘤的耐藥形成中也發(fā)揮著至關重要的作用。在對人非小細胞肺癌細胞和耐順鉑細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，在耐藥細胞中miRNA-21表達水平明顯高于親本細胞，且下調耐藥細胞中miRNA-21的表達水平可明顯逆轉耐藥細胞對順鉑的敏感性［6］。在食管癌EC9706細胞中，miRNA-21可降低EC9706/DDP細胞對順鉑的耐藥性［10］。但是miRNA-21是否參與及通過何種機制調節(jié)口腔鱗癌細胞的耐藥，目前尚未有相關文獻報道。

我們的研究首次發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在順鉑耐藥口腔鱗癌細胞株Tca8113/DDP中表達水平明顯高于其親本細胞Tca8113；通過上調Tca8113細胞中miRNA-21的表達可促進其對順鉑的耐藥，下調Tca8113/DDP細胞中miRNA-21表達可逆轉其對順鉑的耐藥。由此可證實，miRNA-21參與了口腔鱗癌細胞耐藥的調節(jié)。

為了進一步明確miRNA-21通過何種機制調控Tca8113/DDP細胞的耐藥，我們應用在線生物信息學miRNA靶基因預測軟件miRanda對miRNA-21的靶基因進行了預測，結果提示PTEN可能為miRNA-21的靶基因之一。PTEN基因全長200 kb，包含有9個外顯子和8個內含子，編碼是一個由403個氨基酸殘基組成的蛋白，是最早發(fā)現(xiàn)的具有磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，能夠維持正常的物質代謝和內環(huán)境自穩(wěn)態(tài)。PTEN是已經(jīng)公認的在人類腫瘤中最容易突變的腫瘤抑制基因之一，細胞突變后可導致易患腫瘤綜合征，能夠抑制磷脂酰肌醇3-激酶蛋白家族的活性，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切［11］。研究人員在乳腺癌、肺癌、胃癌等腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)PTEN低表達，且與疾病嚴重程度有關，在該腫瘤中起負性調節(jié)作用［12］。口腔鱗狀細胞癌中亦發(fā)現(xiàn)PTEN低表達，PTEN蛋白的表達水平與臨床分期及分化程度有關，較低PTEN水平伴淋巴結轉移的風險升高［13～14］。以上研究結果提示PTEN低表達在腫瘤發(fā)生發(fā)展具有重要作用。

為了證明在口腔鱗癌中miRNA-21和PTEN基因之間的調控關系，我們對口腔鱗癌細胞株進行miRNA-21 mimics和inhibitor的轉染分別促進和抑制miRNA-21的表達，Western blot實驗證實通過上調或下調miRNA-21的表達，相應細胞中PTEN的表達水平也下調或上調。然后我們應用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗證兩者之間的靶向調控關系，證明了miRNA-21可以直接調控PTEN基因，與Yang等［7］研究結果一致。在后續(xù)研究中，我們將對PTEN在口腔鱗癌細胞中發(fā)揮的生物功能進行深入研究。并將進一步研究在口腔鱗癌細胞中PTEN作為miRNA-21的靶基因是否介導了miRNA-21對口腔鱗癌細胞耐藥的調節(jié)。

綜上所述，miRNA-21在口腔鱗癌耐順鉑細胞Tca8113/DDP中異常高表達，下調其表達可部分逆轉Tca8113/DDP對順鉑的耐藥性，這可能為臨床上治療口腔鱗癌耐藥提供新的靶點。miRNA-21可能通過作用于PTEN，參與調控口腔鱗癌順鉑耐藥的發(fā)生發(fā)展，具體調控機制尚待進一步研究。

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Expressions of MicroRNA-21 in Oral Squamous Cell Carcinoma and Its Correlation with Drug Resistance by Targeting PTEN

CHEN Jian-ping1，WANG Ping2，YANG Gen-ping2，OUYANG Shao-bo3，HUANG Zi-kun4
（1Department of Stomatology，the People's Hospital of Xiangdong District of Pingxiang City，Jiangxi337055；2Department of Stomatology，the TCM Hospital of Xiangdong District of Pingxiang City，Jiangxi337016；3Affiliated Oral Hospital of Nanchang University，Jiangxi330006；4Department of Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Jiangxi330006）

Objective:To investi gate the expression of microRNA-21（miRNA-21）in cisplatin-resistant oral squamous cell carcinoma cells and its mechanism.Methods:Real-time PCR（RT-PCR）was used to detect the expression of miRNA-21 in cisplatin-resistant oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113/DDP and its parent cell line Tca8113.miRNA-21 mimics and miRNA-21 inhibitor in vitro was transiently transferred into Tca8113 and Tca8113/DDP cells respectively.The expression level of miRNA-21 was detected by RT-PCR.Cell viability was analyzed by CCK8 assay.Expression of epithelial membrane protein-1（PTEN）protein was detected by Western blot.Bioinformatics software predicted the potential target genes of miRNA-21 and dual luciferase reporter gene was used to analyze the binding between miRNA-21 and 3'-UTR of PTEN.Results:The expression level of miRNA-21 was up-regulated in Tca8113/DDP cells as compared with Tca8113 cells（P＜0.01）.The relative expression level of miRNA-21 in miRNA-21 mimics-transfected Tca8113 was significantly increased.Over-expression of miRNA-21 inhibited cisplatin chemosensitivity（P＜0.05），and the up-regulation of miRNA-21 led to a significant decrease in the PTEN protein levels（P＜0.05）.The relative expression 1evel of miRNA-21 in miRNA-21 inhibitor-transfected Tca8113/DDP was significantly decreased.Low-expression of miRNA-21 promoted cisplatin chemosensitivity（P＜0.05），and the down-regulation of miRNA-21 led to a significant increase in the PTEN protein levels（P＜0.05）.Dual luciferase reporter gene assay indicated that miRNA-21 regulated PTEN expression by binding to the 3'-UTR of PTEN mRNA.Conclusions:The expression of miRNA-21 was up-regulated in Tca8113/DDP cells.Down-regulation the expression of miRNA-21 could partially reverse the cisplatin-resistance.miRNA-21 may play a vital role in oral squamous cell carcinoma drug resistance by targeting PTEN.

Oral squamous cell carcinoma；MicroRNA-21；Cisplatin；Drug resistance；PTEN

R739.8

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2015.12.006

2015-08-26）