張　勇， 朱曉宇， 郭勝亞， 李春?jiǎn)?/p>

（杭州環(huán)特生物科技有限公司， 浙江 杭州 311231）

苯肼誘發(fā)建立斑馬魚血栓模型的方法

張勇， 朱曉宇， 郭勝亞， 李春?jiǎn)?/p>

（杭州環(huán)特生物科技有限公司， 浙江 杭州 311231）

目的建立操作便捷、快速、穩(wěn)定的活體斑馬魚血栓模型。方法研究不同濃度苯肼誘導(dǎo)下斑馬魚血栓形成情況。以2dpf （days post fertilization， dpf， 受精后天數(shù)）健康A(chǔ)B系野生型斑馬魚作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物， 將其暴露于不同濃度（0.5 μmoL/L、1 μmoL/L、2 μmoL/L、4 μmoL/L、8 μmoL/L）的苯肼中， 同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（胚胎養(yǎng)殖用水）和溶劑對(duì)照組（0.1%乙醇）， 處理一段時(shí)間后， 通過(guò)觀察斑馬魚尾靜脈血流及血栓形成情況進(jìn)行定性分析， 利用鄰聯(lián)茴香胺染色法對(duì)心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行定量分析。結(jié)果苯肼處理組（模型組）有血栓形成，與溶劑對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.001）。血栓形成率先增高后逐漸減緩， 0.5 μmoL/L、1 μmoL/L血栓形成較少， 血栓形成率分別為（19.79±1.55）%、（43.28±1.82）%、2 μmoL/L、4 μmoL/L、8 μmoL/L均誘發(fā)較為嚴(yán)重的血栓， 血栓形成率分別為（69.85±1.12）%、（70.56±4.60）%和（72.25±2.11）%，三組間沒(méi)有差異。結(jié)論苯肼濃度2 μmoL/L為誘發(fā)穩(wěn)定的活體斑馬魚血栓模型的最佳濃度。

斑馬魚； 模型； 苯肼； 血栓

隨著人類生活環(huán)境和膳食習(xí)慣的變化，心、腦血管病的發(fā)病率和死亡率正逐年增高。血栓性疾病是一種常見(jiàn)心腦血管病，其主要病癥是血管內(nèi)腔狹窄與閉塞引發(fā)。如何對(duì)血栓性疾病進(jìn)行有效的診斷、預(yù)防和治療，已為國(guó)內(nèi)外普遍重視。在血栓性疾病研究過(guò)程中，已經(jīng)建立了許多動(dòng)物血栓模型，但小鼠等哺乳動(dòng)物模型普遍存在著實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)以及實(shí)驗(yàn)成本高等問(wèn)題，因此建立操作便捷、快速、可靠，且與臨床病理生理機(jī)制相似的血栓動(dòng)物模型對(duì)于抗栓藥物的研究是十分必要的［1］。斑馬魚模型用于新藥篩選始于1990 年代，斑馬魚作為一種新的模式動(dòng)物，由于其快速、經(jīng)濟(jì)、預(yù)測(cè)性好、可比度高等特點(diǎn)，在發(fā)育、遺傳、免疫、腫瘤和毒理等諸多研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用［2］。斑馬魚與人類基因組的相似度高達(dá)87%， 由于斑馬魚幼魚通體透明， 血細(xì)胞在心臟和血液循環(huán)系統(tǒng)的堆積非常容易觀察，因而利用斑馬魚模型研究心臟畸形及血栓形成也極為方便［3］。本文采取通過(guò)化學(xué)藥物苯肼誘導(dǎo)活體斑馬魚形成血栓，建立可靠、快速、高效、高性價(jià)比的血栓模型。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚為AB系野生型斑馬魚，取自杭州環(huán)特生物科技有限公司。斑馬魚的養(yǎng)殖與繁殖參照Westerfield［4］的方法。每次交配準(zhǔn)備4～5對(duì)成年斑馬魚，平均每對(duì)能產(chǎn)200～300個(gè)胚胎。在受精后6 h（即 6 hpf， hours post fertilization）和 24 hpf對(duì)胚胎進(jìn)行清理（移除已死亡胚胎），并根據(jù)胚胎的發(fā)育階段挑選合適的胚胎。在28 ℃ 條件下用養(yǎng)魚用水孵育胚胎，因?yàn)榕咛タ梢詮淖陨淼穆腰S囊中獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，所以在9 dpf （days post fertilization）內(nèi)不需要喂食。實(shí)驗(yàn)完成后，用三卡因甲磺酸對(duì)各個(gè)發(fā)育階段的斑馬魚進(jìn)行過(guò)度暴露處理，從而將斑馬魚麻醉處死。麻醉處死的操作步驟符合美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)（AVMA）對(duì)動(dòng)物麻醉處死的規(guī)范要求。

1.2儀器與試劑

苯肼（阿拉?。?、乙醇（杭州長(zhǎng)征化學(xué)試劑有限公司）， 解剖顯微鏡（SMZ645，Nikon公司，日本），電動(dòng)聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100， Nikon公司，日本），12孔板（Nest Biotech）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

在斑馬魚胚胎發(fā)育至2 d時(shí)，在解剖顯微鏡挑選發(fā)育正常的斑馬魚胚胎，將其分到微孔板中，每孔30尾， 設(shè)置7個(gè)實(shí)驗(yàn)組: 5個(gè)血栓誘導(dǎo)劑處理組（0.5 μmol/L、1 μmol/L、2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L）、1個(gè)溶劑對(duì)照組（0.1%的酒精）、1個(gè)空白對(duì)照組（胚胎養(yǎng)殖用水）。之后28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d。

1.4觀察指標(biāo)和方法

1.4.1定性觀察分析處理結(jié)束后，移除微孔板中的液體，加入等體積濃度為0.64 mmol/L的甲磺酸麻醉斑馬魚，用3%甲基纖維素膠固定于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚尾靜脈血栓形成情況，通過(guò)觀察對(duì)比血栓誘導(dǎo)劑處理組中斑馬魚尾靜脈血栓形成情況可定性確定斑馬魚血栓模型所使用的最佳誘導(dǎo)劑濃度。

1.4.2定量觀察分析 實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)斑馬魚尾靜脈血栓長(zhǎng)度與心臟紅細(xì)胞數(shù)（紅細(xì)胞染色強(qiáng)度）成反比，兩者之間呈明顯的相關(guān)性（相關(guān)系數(shù)γ＞95%）（圖1），因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)定量斑馬魚心臟中的紅細(xì)胞染色強(qiáng)度對(duì)血栓進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。

用鄰聯(lián)茴香胺染色液（含0.6 mg/mL鄰聯(lián)茴香胺、0.01 mol/L醋酸鈉、0.65%H2O2、40%乙醇）對(duì)血栓誘導(dǎo)劑處理組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組進(jìn)行染色，整個(gè)染色過(guò)程需避光操作，步驟如下:

1）移除微孔板中的液體，用移液槍吸取等體積鄰聯(lián)茴香胺染色液于微孔板中；2）將微孔板置于28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～15 min；3）取出微孔板，移除染色液，用DMSO快速清洗3遍；4）將斑馬魚轉(zhuǎn)入新的微孔板中，加入等體積DMSO。

將斑馬魚側(cè)位放置于雙凹載玻片上后，置于熒光顯微鏡下對(duì)心臟部位進(jìn)行拍照并保存。利用尼康NIS-Elements D3.10高級(jí)圖像處理軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度。血栓形成率計(jì)算公式如下:

圖1　斑馬魚尾靜脈血栓長(zhǎng)度與心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度呈線性相關(guān)性

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1定性觀察

解剖顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組中斑馬魚尾靜脈血流正常，無(wú)血栓形成； 隨著苯肼濃度的增加， 血栓模型組血流逐漸減慢直至停止。0.5 μmol/L、1 μmol/L處理組斑馬魚尾靜脈血流減慢， 血栓形成較少； 2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L苯肼處理組斑馬魚血栓形成增多，血流緩慢或停止（圖2）。因此， 定性確定可以將苯肼最低2 μmol/L作為建立活體斑馬魚血栓模型的最佳誘導(dǎo)劑濃度。

2.2定量分析

經(jīng)鄰聯(lián)茴香胺染色后， 發(fā)現(xiàn)隨著苯肼濃度的增加， 斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度逐漸降低（圖3、圖4），尾部血栓形成率先增高后逐漸減緩（圖5）。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示: 5個(gè)血栓模型組的血栓形成率分別為（19.79±1.55）%、（43.28±1.82）%、（69.85±1.12）%、（70.56±4.60）%、（72.25±2.11）%。通過(guò)方差分析， 濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L的誘導(dǎo)劑處理組血栓形成率顯著高于前兩組， 與對(duì)照組相比，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P＜0.001）； 而2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L三個(gè)誘導(dǎo)劑處理組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此通過(guò)定量分析， 亦可以確定將苯肼最低2 μmol/L作為建立斑馬魚血栓模型的最佳誘導(dǎo)劑濃度。

圖2　斑馬魚尾靜脈血栓形成（紅圈標(biāo)注為血栓）

圖3　斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色示意圖（箭頭所指為斑馬魚心臟）

圖4　各組斑馬魚心臟紅細(xì)胞染色強(qiáng)度

圖5　苯肼濃度與斑馬魚血栓形成的關(guān)系

3　討論

血栓動(dòng)物模型的建立方法可分為物理?yè)p傷法和化學(xué)損傷法。物理?yè)p傷法包括機(jī)械損傷法、股動(dòng)脈異物法、電流損傷法和結(jié)扎法；化學(xué)損傷法包括胰蛋白酶血栓形成法、過(guò)氧化氫血栓形成法、角叉菜膠血栓形成法、三氯化鐵血栓形成法和光化學(xué)法［5］。近年來(lái)化學(xué)藥物誘導(dǎo)血栓形成法被廣泛應(yīng)用，其原理是利用化學(xué)物質(zhì)損傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)血小板黏附、聚集和促進(jìn)血管活性物質(zhì)的釋放，形成閉塞性血栓［6］。這是一種原位血栓形成的方法，能較好地模擬人類血栓形成的發(fā)病過(guò)程，為抗血栓藥物的評(píng)價(jià)與篩選工作提供了較好的途徑。Kuzz等［7］首次報(bào)道了FeCl3誘導(dǎo)的大鼠頸總動(dòng)脈血栓形成模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示這種模型可靠、形成簡(jiǎn)便、快捷，血栓模型成功率100%，而且可以控制血栓形成的程度。但是該動(dòng)物模型技術(shù)要求高、手術(shù)創(chuàng)傷大、并發(fā)癥和死亡率高、容易引起血管痙攣等［8］。

苯肼能夠損傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)血小板黏附、聚集及血管活性物質(zhì)的釋放［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)苯肼誘導(dǎo)成功建立了活體斑馬魚血栓模型，對(duì)斑馬魚尾靜脈血栓的形成進(jìn)行了定性和定量分析。該模型的建立存在以下優(yōu)點(diǎn)：①活體內(nèi) 實(shí)驗(yàn)材料為活體斑馬魚，作為一種脊椎動(dòng)物，其篩選模型屬體內(nèi)模型，能夠真實(shí)反映藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝與排泄，真正反映藥物的整體生物活性； ②高通量 斑馬魚胚胎很小［10］，幼魚只有1～4 mm，能夠在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的6，12，24，48，96或384孔板內(nèi)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)周期短使斑馬魚成為一種能進(jìn)行高通量全自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)的理想體內(nèi)篩選模型； ③經(jīng)濟(jì)所需費(fèi)用低；④簡(jiǎn)便 實(shí)驗(yàn)過(guò)程操作簡(jiǎn)單，斑馬魚經(jīng)藥物處理、染色后便可進(jìn)行定量與定性分析，而傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程復(fù)雜；⑤快速實(shí)驗(yàn)周期短，可在2～3 d內(nèi)完成；而大、小鼠常需要數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間，猴常需要數(shù)月至數(shù)年時(shí)間。斑馬魚在第一個(gè)72 h以內(nèi)完成胚胎發(fā)育。多數(shù)的內(nèi)部器官，包括心血管系統(tǒng)、腸、肝臟和腎，在24～48 h內(nèi)快速成型，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)載體大鼠、小鼠和猴則分別需要21 d和9個(gè)月方可完成胚胎發(fā)育； ⑥高效斑馬魚與人類基因高度相似（70%～80%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果可比性強(qiáng)。斑馬魚的生理和新陳代謝系統(tǒng)構(gòu)成與哺乳類動(dòng)物極為相似，因此，斑馬魚篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性與哺乳類動(dòng)物相比可達(dá)80%以上；⑦直觀性強(qiáng)胚胎及幼魚透明［11］，可直接置于顯微鏡下觀察血栓形成及溶栓情況； ⑧敏感性高苯肼?lián)p傷血管內(nèi)膜，促進(jìn)血小板黏附、聚集及血管活性物質(zhì)釋放的敏感性很高，本實(shí)驗(yàn)用很低濃度的苯肼即可誘導(dǎo)斑馬魚血栓形成；⑨穩(wěn)定性高、重復(fù)性好。

綜上所述，2 μmol/L的苯肼即可以成功誘導(dǎo)建立穩(wěn)定的活體斑馬魚血栓模型，該血栓模型具有獨(dú)特的創(chuàng)新之處，對(duì)于診斷和治療血栓性疾病，對(duì)于抗血栓藥物的評(píng)價(jià)與篩選工作亦具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。

［1］楊光華. 病理學(xué)［ M］. 北京: 人民衛(wèi)生出版社， 2001:43-47.

［2］He JH， Guo SY， Zhu F.A zebrafish phenotypic assay for assessing drug-induced hepatotoxicity［J］. J Pharmacol Toxicol Methods， 2013， 67（1）:25-32.

［3］陳汝家， 朱俊靖， 周盛梅， 等. 斑馬魚模型在藥物毒性與安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用［J］. 毒理學(xué)雜志， 2012， 26（3）:224-227.

［4］Westerfield M. The Zebrafish Book ［M］. Eugene: University of Oregon Press.1995:16-21.

［5］周文國(guó)， 柴瑞華， 程嘉藝， 等. 改良光化學(xué)法動(dòng)物血栓模型的建立［J］. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2008， 26（4）:814-815.

［6］任開環(huán)， 呂莉， 韓國(guó)柱. 血栓形成動(dòng)物模型的研究概況［J］.醫(yī)學(xué)導(dǎo)報(bào)， 2005， 24（6）:505-507.

［7］Kurz KD， Ain BW， Sandusky GE. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride［J］. Thromo Res， 1990， 60（4）:269-280.

［8］魏汝云， 徐婧婧， 王淑貞. 基質(zhì)金屬蛋白酶-9與腦缺血損傷的關(guān)系研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志， 2007， 17:567.

［9］Gregory M， Hanumanthaiah R， Jagadeeswaran P. Genetic analysis of hemostasis and thrombosis using vascular occlusion［J］. Blood cells. Mol Dis， 2002， 29（3）:286-295.

［10］ 李乙根， 黃文瑾， 黃誠(chéng)， 等. 斑馬魚在新藥發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用［J］.生命科學(xué)， 2011， 23（3）:274-278.

［11］ 高世榮， 孫鳳英， 潘力軍， 等. 斑馬魚作為模式生物在人類疾病起因方面的研究［J］. 中國(guó)環(huán)境衛(wèi)生， 2006， 9（4）:26-31.

［Abstrac］ObjectiveTo develop an in vivo thrombosis model in live zebrafish. Methods AB strain zebrafish at 2 days post fertilization （dpf） were treated with various concentrations of phenyl hydrazine （0.5 μmol/L， 1 μmol/L， 2 μmol/L， 4 μmol/L and 8 μmol/L） for 24 hours and the venous blood speed and thrombosis in zebrafish were qualitatively assessed under a dissecting microscope. Subsequently， venous thrombus was quantified through measuring red blood cells stained with o-Dianisidine staining in zebrafish heart. Untreated zebrafish and zebrafish treated with 0.1% ethanol （vehicle） were used as controls. ResultsReduced venous blood speed and thrombosis were observed in all the groups of zebrafish treated with phenyl hydrazine at concentrations from 0.5 μmol/L from 8 μmol/L. Thrombosis in zebrafish treated with 0.5 μmol/L， 1 μmol/L， 2 μmol/L， 4 μmol/L and 8 μmol/L of phenyl hydrazine were（19.79± 1.55）%， （43.28±1.82）%，（69.85±1.12）%， （70.56±4.60）% and （72.25±2.11）%， respectively. ConclusionPhenyl hydrazine can induce thrombosis in zebrafish with an optimum concentration at 2 μmol/L and this thrombosis model may be useful for rapidly in vivo drug screening in live zebrafish.

Zebrafish Thrombosis Model Induced by Phenyl Hydrazine

ZHANG Yong， ZHU Xiao-yu， GUO Sheng-ya， LI Chun-qi
（Hunter Biotechnology Inc.， Hangzhou 311231， China）

Zebrafish； Model； Phenyl hydrazine； Thrombus

Q95-33

A

1674-5817（2015）01-0027-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.01.006

2014-06-30

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C37093）

張勇（1980 - ）， 男， 工程師， 研究方向: 斑馬魚生物技術(shù)及新藥研發(fā)。zy@zhunter.com

李春?jiǎn)ⅲ?博士， 教授， 研究方向: 斑馬魚生物技術(shù)及新藥研發(fā)