劉　雷， 王寶珠， 勞荃蘅， 劉　民， 薛整風(fēng)， 季明春

（1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心， 蚌埠233030；2. 揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心， 揚州 225009； 3. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 揚州 225001）

·華東地區(qū)第十三屆實驗動物科學(xué)學(xué)術(shù)交流會優(yōu)秀論文選刊·

bcr啟動子驅(qū)動增強綠色熒光蛋白表達轉(zhuǎn)基因小鼠的制備和初步鑒定

劉雷1， 王寶珠2， 勞荃蘅1， 劉民1， 薛整風(fēng)2， 季明春3

（1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院實驗動物中心， 蚌埠233030；2. 揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心， 揚州 225009； 3. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 揚州 225001）

目的制備bcr啟動子驅(qū)動-增強綠色熒光蛋白（bcr-EGFP）轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在活體水平驗證bcr啟動子的啟動特異性。方法以慢性髓性細胞白血?。–ML）細胞株K562細胞基因組為模板，PCR擴增1.1 kb bcr啟動子， 在擴增產(chǎn)物的上、下游引物加入了Ase I、EcoR I酶切位點，AseI、EcoRI雙酶切pEGFP-N1真核表達質(zhì)粒載體，去除載體自身的CMV啟動子，并將1.1 kb bcr啟動子定向克隆到EGFP綠色熒光蛋白報告基因上游，構(gòu)建pbcr-EGFP真核表達載體，并將此重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染K562細胞和NIH3T3細胞，進行表達驗證。顯微注射法制備bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，采用PCR方法進行初步整合檢測。結(jié)果顯微注射583枚受精卵，移植到30只受體鼠輸卵管中，受體鼠妊娠26只，共生產(chǎn)首建鼠90只， 經(jīng)過PCR檢測，4#（♀）、36#（♂）和81#（♂）等3只F0代為轉(zhuǎn)基因整合陽性鼠。結(jié)論成功制備了bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，為進一步研究bcr啟動子在CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備的安全性和可靠性提供線索和幫助。

慢性髓性白血?。–ML）； bcr啟動子； 增強綠色熒光蛋白（EGFP）； 轉(zhuǎn)基因小鼠

慢性髓細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia， CML）是第一個被證實為獲得性基因異常引起的惡性腫瘤［1］。由t（9， 22）（q34； q11）染色體易位所形成的BCR-ABL融合基因及其編碼的融合蛋白在CML的發(fā)病中起了至關(guān)重要的作用。自1990年代，科學(xué)家們一直在使用不同的啟動子試圖建立成功模擬人類CML的小鼠模型。1991年Heisterkamp等利用bcr啟動子控制BCR-ABL基因的表達來制備CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型，結(jié)果可能由于基因構(gòu)建的產(chǎn)物對小鼠胚胎的生長有毒性作用，沒有得到存活的后代［2］。1995年，Voncken等［3］利用鼠源MT-1啟動子控制BCR-ABL基因表達制備轉(zhuǎn)基因小鼠模型，結(jié)果形成了前B急性淋巴細胞白血病。1998 年Honda等［4］用Tec基因的啟動子序列構(gòu)建表達BCR-ABL融合蛋白p210bcr-abl的轉(zhuǎn)基因小鼠， 最終這些小鼠死于急性淋巴細胞性白血?。ˋLL）。此后，Huettner 、Tenen 、Koschmieder等［5，6］將Tet-off誘導(dǎo)表達系統(tǒng)在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)p210BCR-ABL的表達但制備出的轉(zhuǎn)基因小鼠均存在明顯的不足之處。

以上幾種轉(zhuǎn)基因小鼠中也有產(chǎn)生類似CML疾病表現(xiàn)的癥狀，但是總存在著缺點和不足，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠絕大部分疾病表現(xiàn)并不與人的CML疾病表現(xiàn)相似。造成這一瓶頸的原因，就是缺少一個合適的啟動子能夠控制BCR-ABL融合基因在適當(dāng)?shù)臅r期和合適的細胞內(nèi)表達。bcr啟動子是調(diào)控BCR-ABL表達的天然啟動子，是制備CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型的首選啟動子。若直接用bcr啟動子控制P210bcr-abl蛋白的表達，會引起小鼠在胚胎期死亡。Tet-on誘導(dǎo)系統(tǒng)的引入便可以使這一問題得以解決，因為該系統(tǒng)是通過添加誘導(dǎo)劑來控制目的基因的定時、定量表達。但是，bcr啟動子在小鼠體內(nèi)是否具有髓系表達的特異性，國內(nèi)、外文獻尚無報道。本實驗使用1.1 kb bcr啟動子控制的增強綠色熒光蛋白（EGFP）報告基因，采用顯微注射方法制備bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠，在活體水平驗證bcr啟動子的表達特性。為CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型的成功制備提供更加充分的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、細胞和動物pMD18-T-bcr 1.5 kb和pEGFP-N1質(zhì)粒、E.coli DH5α菌株、K562與NIH3T3細胞為揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物及免疫實驗室儲存； 實驗所用的小鼠均由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供［SCXK（蘇）2002-0009］。

1.1.2主要試劑限制性內(nèi)切酶、Calf Intestine Alkaline Phosphatase購自Fermentas公司和小牛血清為杭州四季清公司產(chǎn)品； 培養(yǎng)基RPMI 1640、DMEM 為Invitrogen公司產(chǎn)品； GeneRulerTMDNA Ladder Mix購自Fermentas公司； RNase、DNA Ligation Kit、Tag DNA Polymerase均購自Takara公司； 質(zhì)粒小提試劑盒購自杭州愛思進生物技術(shù)有限公司； 膠回收試劑盒購自Qiagen公司； 轉(zhuǎn)染試劑盒購自Roche公司；M2培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液及透明質(zhì)酸酶為Sigma公司產(chǎn)品； 注射用人絨毛膜促性腺激素（hCG）購自珠海麗珠制藥廠； 孕馬血清（PGSG）購自上海計劃生育科學(xué)研究所，其它均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.11.1 kb bcr啟動子基因克隆pMD18-T-bcr 1.5 kb克隆載體為揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物及免疫實驗室構(gòu)建并保存，其中1.5 kb的bcr啟動子來源于K562細胞基因組，載體經(jīng)測序驗證，無堿基突變。根據(jù)人bcr啟動子序列（GenBank X52828.1），利用Oligo6 Demo軟件設(shè)計PCR擴增bcr啟動子的特異性引物。bcr啟動子引物上游引物上加入AseⅠ酶切位點，下游引物加入EcoR I 酶切位點， bcr引物序列為，F(xiàn)：5'-GCATTAATGGCCGCCCCCTTAGAGGGAGGC-3'， R：5'-GCGAATTCGCACCGCCCCACAGCCC-CGCCG-3'，預(yù)計擴增片段大小1.1 kb。以pMD18-T-bcr 1.5 kb克隆載體為模板，PCR擴增1.1 kb的bcr啟動子基因序列，Ase I，EcoR I酶切回收制備含有酶切位點的bcr啟動子。

1.2.2pbcr-EGFP表達載體的構(gòu)建與測序Ase I、EcoR I酶切線性化pEGFP-N1載體，將制備1.1 kb 的bcr啟動子與線性化的pEGFP-N1載體的連接，操作方法參照大連寶生物公司的DNA Ligation Kit說明書進行。取連接產(chǎn)物10 μL轉(zhuǎn)化DH5α菌株感受態(tài)細胞，次日挑取單菌落，擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA，篩選陽性克隆pbcr-EGFP。質(zhì)粒小量抽提，用Ase I，EcoR I酶切鑒定。將上述經(jīng)酶切鑒定為陽性的克隆菌，穿刺接種到含Kan（100 μg/mL）的LB半固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，次日寄送大連寶生物工程有限公司公司測序。并對測序結(jié)果利用DNAMAN和DNASAR軟件進行序列分析，并用BLAST程序與GeneBank中發(fā)表的bcr啟動子序列進行比較。

1.2.3pbcr-EGFP體外瞬時表達檢測利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Roche公司）按FUGENE和報告基因載體不同的比率（12∶2，12∶4，12∶8，12∶12）做梯度轉(zhuǎn)染K562、NIH3T3細胞。簡要步驟如下：6孔板內(nèi)接種對數(shù)生長期的細胞，次日更換無血清的培養(yǎng)基。在無菌EP管中先加入無血清的培養(yǎng)基，然后加入FUGENE試劑到培養(yǎng)基中，補足100 μL。加入1～2 μg pbcr-EGFP質(zhì)粒，混勻，室溫放置30 min， 均勻地加入到細胞中，輕輕混勻，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)5 h，更換含體積分?jǐn)?shù)20%小牛血清的完全培養(yǎng)基。37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，采用熒光顯微鏡定性檢測EGFP，鏡下拍照。其中設(shè)立pEGFP-N1作為陽性對照。

1.2.4顯微注射法制備bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠AseI、Afl Ⅱ雙酶切重組質(zhì)粒pbcr-EGFP獲得線性化bcr-EGFP目的基因片段， 回收純化、定量為2～4 ng/mL，備用。采用雄性原核顯微注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠，加強受體母鼠及其后代仔鼠的日常飼養(yǎng)管理。1.2.5bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR初步檢測Oligo 6 Demo軟件設(shè)計bcr-EGFP特異性引物， F： 5'-CCTCGTGACCACCCTGACCTA-3'， R： 5'-ATGTGATCGCGCTTCTCGTT-3'，預(yù)計擴增片段大小為477 bp。常規(guī)方法提取待檢鼠尾基因組DNA， 進行PCR初步檢測。PCR反應(yīng)體系25 μL： Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、25 mmol/L Mg2+2 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL、基因組模板2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各 1 μL， PCR反應(yīng)程序： 94 ℃ 4 min、94 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72℃ 1 min （30個循環(huán)）、72℃ 10 min。4℃保存， 60 mg/L瓊脂糖凝膠電泳， 80 V， 40 min， 凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

2　結(jié)果

2.11.1 kb bcr啟動子基因的克隆

以pMD18-T-bcr 1.5 kb克隆載體為模板，用合成的針對1.1 kb bcr啟動子的特異性引物進行PCR擴增，得到長約1.1 kb（圖1）的啟動子片段。

2.2pbcr-EGFP表達載體的構(gòu)建與測序

用1.1 kb的bcr啟動子替換pEGFP-N1的CMV啟動子，酶切鑒定結(jié)果如圖2，Ase I和EcoR I雙酶切片段大小為4.1 kb和1.1 kb。陽性克隆使用正反向測序引物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)序列比對，作者所克隆的bcr啟動子序列與人bcr啟動子序列（X52828.1）1.1 kb區(qū)域的同源性達到100%。

2.3pbcr-EGFP體外瞬時表達檢測

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將重新構(gòu)建的pbcr-EGFP質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染K562細胞和NIH3T3細胞，并以pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染作為陽性對照，熒光顯微鏡下定性檢測。結(jié)果顯示pbcr-EGFP在兩種細胞中均能順利表達，瞬時轉(zhuǎn)染表達結(jié)果如圖（圖3、圖4）

2.4bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR初步檢測

共獲得了受精卵1 186枚進行原核注射， 注射后移植數(shù)583枚， 移植受體數(shù)30只， 受體妊娠數(shù)26只，獲得仔鼠90只， 經(jīng)過PCR檢測， 有3只（1♀， 2♂）為目的基因整合陽性的轉(zhuǎn)基因小鼠（圖5～7）。

1： 100 bp DNA marker； 2： 1.1 kb bcr啟動子圖1　PCR擴增短片段的bcr啟動子Lane 1： 100 bp DNA ladder marker； Lane 2： 1.1 kb bcr promoterFigure 1 Results of 1.1kb bcr promoter amplified by PCR

1： GeneRulerTM DNA Ladder Mix； 2：AseI、EcoRI雙酶切pbcr-EGFP質(zhì)粒； 3：pbcr-EGFP質(zhì)粒圖2　重組質(zhì)粒 pbcr-EGFP Ase I、EcoR I雙酶切鑒定Lane 1： Fermentas GeneRulerTMDNA Ladder Mix，Lane 2： Products of pbcr-EGFP digested by AseI and EcoRI，Lane 3： Plasmid pbcr-EGFPFigure 2 Results of products digested by Ase I and EcoR I

A： pbcr-EGFP （×400）； B： pEGFP-N1 （×400）圖3　K562細胞中EGFP蛋白的表達情況Figure 3 Expression of EGFP in K562 transfected with A and B

A： pbcr-EGFP； B： pEGFP-N1圖4　NIH3T3細胞中EGFP蛋白的表達情況Figure 4 Expression of EGFP in NIH3T3 transfected with A and B

M： 250 bp； 1～10： 小鼠樣品， 其中4號為陽性整合小鼠； 11： 陰性對照； 12： 陽性對照； 13-14： 空白對照圖5　F0代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測 （1#～10#）M： 250 bp DNA Marker； 1～10： Mice samples； 4： positive integrated mouse； 11： Normal mouse；12： Positive control； 13-14： BlackFigure 5 The electrophoresis for PCR product of bcr-EGFP F0 mice （1#-10#）

M： 250 bp； 1～10： 小鼠樣品， 其中36#為陽性整合小鼠； 11： 陰性對照； 12： 陽性對照圖6　F0代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測（32#-42#）M： 250 bp DNA Marker； 1～10： Mice samples； 11： Normal mouse； 12： Positive controlFigure 6 The electrophoresis for PCR product of bcr-EGFP F0 mice （32#-42#）

M： 250 bp； 1～12： 小鼠樣品， 其中81#為陽性整合小鼠； 13： 陰性對照； 14： 陽性對照M： 250 bp DNA Marker； 1-12： Mice samples； 81#： Positive integrated mouse；13： Normal mouse； 14： Positive control圖7　F0代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測（73#～84#）Figure 7 The electrophoresis for PCR product of bcr-EGFP F0 mice （73#-84#）

3　討論

3.1bcr啟動子

啟動子功能活性的研究方法通常是將啟動子連接于報告基因的上游，然后瞬時轉(zhuǎn)染靶細胞或者體外轉(zhuǎn)錄分析，通過檢測報告基因的表達量來確定啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。本研究使用選用EGFP基因作為報告基因，由其產(chǎn)生的蛋白綠色熒光具有較高的靈敏度，既便于在熒光顯微鏡下直接觀察EGFP 的表達情況，也可利用流式細胞儀對EGFP表達水平進行定量，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

在轉(zhuǎn)基因疾病模型的研究中， 合適啟動子的選擇是造模成敗的關(guān)鍵，符合要求的啟動子能實現(xiàn)目的基因在正確的位置和合適的時間表達，從而能夠最真實地在動物模型上復(fù)制出疾病的發(fā)生、發(fā)展以及病理特征。在CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型的研究中，目前還沒有適當(dāng)?shù)膯幼涌刂艬CR-ABL融合基因的正確表達。bcr啟動子作為調(diào)控BCR-ABL融合基因的天然啟動子，理論上是建立CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型的首選天然啟動子［7］。本研究參照文獻報道克隆了bcr基因轉(zhuǎn)錄起始點上游約1.1 kb的區(qū)域［8］，將其連接于EGFP的上游， 然后瞬時轉(zhuǎn)染人髓性白血病細胞系K562細胞以及小鼠成纖維細胞系NIH3T3，均觀察到了綠色熒光蛋白的表達。然而在兩種細胞的瞬時轉(zhuǎn)染試驗中，與pCMV-EGFP陽性對照相比，熒光強度要弱一些，原因在于啟動子的差異，人類巨細胞病毒立早啟動子CMV是強啟動子，因此由它啟動的EGFP綠色熒光蛋白的表達量要高于bcr啟動子。轉(zhuǎn)染試驗驗證了該1.1 kb bcr啟動子在人源和鼠源細胞中均具有轉(zhuǎn)錄活性。

3.2bcr-EGFP陽性整合轉(zhuǎn)基因小鼠的后期檢測及

應(yīng)用價值

PCR檢測是轉(zhuǎn)基因小鼠制備中的初步鑒定方法，僅能夠說明目的基因的整合情況， 但目的基因的表達水平鑒定則需要多元化的檢測手段，如較為常用的Western blot及各種生理生化檢測方法。本實驗獲得了3只陽性整合首建鼠，由于人源1.1 kb 的bcr啟動子在小鼠體內(nèi)的時空表達特性尚未得知，因此在做好陽性整合轉(zhuǎn)基因小鼠建系的同時充分利用EGFP報告基因檢測的方便靈活的特性保證表達檢測的連續(xù)性和準(zhǔn)確性。也可能由于位置效應(yīng)（position effect）導(dǎo)致整合的bcr-EGFP基因不發(fā)生表達，即相鄰基因或異染色質(zhì)區(qū)域影響著外源基因的表達，從而導(dǎo)致同樣的基因在不同的轉(zhuǎn)基因個體表達的水平很不一致，該種情況在轉(zhuǎn)基因小鼠制備過程中屬于常見情況。DNA體外轉(zhuǎn)染實驗表明，該啟動子可以啟動BCR-ABL融合基因在人髓性白血病細胞K562及小鼠成纖維細胞NIH3T3中的表達，故以其為啟動子制備轉(zhuǎn)基因小鼠。若整合基因發(fā)生表達，從理論上講，即可在個體中檢測到報告基因的表達。待整合陽性鼠的后代達到一定數(shù)量時，可以取陽性整合小鼠的脾、骨髓、腎等實質(zhì)性器官來檢測EGFP的表達，以期掌握bcr啟動子的具體表達情況。

小鼠與人類有著較為相似的生理與病理過程，因此小鼠模型對人類疾病病理機制的探索和發(fā)現(xiàn)， 有著其他模式生物不可替代的優(yōu)越性。目前已有多個有關(guān)CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型制備的報道， 但其CML疾病表現(xiàn)的癥狀， 總存在著缺點和不足， 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因小鼠絕大部分疾病表現(xiàn)并不與人的CML疾病表現(xiàn)相似， 轉(zhuǎn)基因小鼠模型表現(xiàn)的不足已成為CML相關(guān)研究的一大瓶頸。本實驗成功制備了bcr-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠， 后續(xù)的研究將側(cè)重于bcr啟動子在轉(zhuǎn)基因小鼠活體水平的表達特性， 以期為CML轉(zhuǎn)基因小鼠模型找到一個安全、可靠的“天然”啟動子， 為CML相關(guān)基礎(chǔ)研究提供線索和幫助。

［1］Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia indemnified by quinacrine fluorescence and Giemasa staining ［J］. Nature， 1973， 243 （5405）： 290-293.

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Preliminary Study on Development of bcr Promotor Driven EGFP Expressing Transgenic Mice

LIU Lei1， WANG Bao-zhu2， LAO Quan-heng1， LIU Min1， XUE Zheng-feng2， JI Ming-chun3
（1. Laboratory Animal Center， Bengbu Medical Collage， Bengbu 233030， China；2. Comparative Medical Center， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China；3. School of Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225001， China）

ObjectiveTo establish the bcr promoter drived green fluorescerce protein（bcr-EGFP）transgenic mouse model and to analyze the specificity of bcr promoter for further in vivo study.

Chronic myelogenous leukemia（CML）； bcr promoter； Green fluorescence protein（EGP）；Transgenic mouse

Q95-33

A

1674-5817（2015）02-0149-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2015.02.013

2014-06-30

國家自然科學(xué)基金面上項目（30771955）

劉雷（1982-）， 男， 碩士， 研究方向： 人類疾病動物模型研究。E-mail：174462586@qq.com

季明春， 教授。E-mail： mcji@yzu.edu.cn

MethodsThe 1.1 kb bcr promoter was obtained from the genome of K562 cells （chronic myeloid leukemia cell line）， at the same time， two restriction sites of Ase I、EcoR I were introduced into the up and down streams of this promoter. The CMV promoter of pEGFP-N1 plasmid was replaced by 1.1 kb bcr promoter to restructure pbcr-EGFP plasmid. Transfect the new recombinant plasmid into K562 cells and NIH3T3 cells by liposomes， after 24 hours， the expression was observed with fluorescentce. The results showed that this vector was constructed successfully. The bcr-EGFP recombinant fragment was obtained from pbcr-EGFP plasmid， and used to establish bcr-EGFP transgenic mouse by microinjection and the integration of target gene was detected by PCR. ResultsTotal of 583 eggs of C57BL/6 were microinjected with the bcr-EGFP fragment. These eggs were transferred into 30 foster female mice，and 26 of which were pregnant and 90 pups were obtained， among which 3 pups （1♀， 2♂） were transgenic mice. ConclusionThe successful establishment of bcr-EGFP transgenic mouse model has paved the way for future study of the specificity of bcr promoter.