艾尼娃爾·巴巴依

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 病理科，新疆 烏魯木齊830001）

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年約100萬(wàn)人發(fā)生CRC，且患者5年病死率高達(dá)50%［1］。近年來(lái)，CRC在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤的前列，且呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)［2］。CRC腫瘤組織轉(zhuǎn)移、侵襲是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。P53基因是一種抑癌基因，在正常細(xì)胞中表達(dá)水平較低，具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［3］，而其發(fā)生突變后，喪失了抑癌作用，且具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用［4］。Ki－67是增殖細(xì)胞最明顯的標(biāo)志，可用于腫瘤惡性程度的判斷，與腫瘤臨床分期、組織學(xué)分級(jí)相關(guān)［5］。人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2基因（Human epidermal growth factor receptor 2，HER－2）是一種原癌基因，與多種惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后存在相關(guān)性，其陽(yáng)性表達(dá)多見(jiàn)于肺癌、胃癌、前列腺癌等［6］。因此，筆者選擇2009年1月—2014年1月在我院行手術(shù)切除的CRC患者80例為研究對(duì)象，探討P53、ki－67和 HER－2基因表達(dá)與CRC臨床病理特征的關(guān)系，以期為臨床CRC的診斷、治療和預(yù)后判斷提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2009年1月—2014年1月在我院行手術(shù)切除的80例CRC患者為研究對(duì)象，其中男42例，女38例，年齡31－76歲，平均年齡（56.37±8.29）歲；病變部位：直腸 42例（52.50%），左半結(jié)腸（包括乙狀結(jié)腸、結(jié)腸脾曲及乙直交界）21例（26.25%），右半結(jié)腸（包括橫結(jié)腸、結(jié)腸肝曲及回盲部）17例（21.25%）。所有CRC患者術(shù)前均未進(jìn)行放療及化療治療，其中發(fā)生腸系膜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例（38.75%）；采用WHO 2010年提出的消化道腫瘤組織學(xué)分級(jí)及改良Dukes分期：A期41例，B例9例，C期30例，無(wú)D期患者。

1.2 方法

所有外檢標(biāo)本均在癌組織取下后，即刻用4%甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度約4μm。所得切片分別進(jìn)行P53、Ki－67和 HER－2檢測(cè)，P53及 Ki－67用檸檬酸鹽緩沖液高壓加熱3min進(jìn)行修復(fù)，HER－2采用EDTA修復(fù)液（購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）進(jìn)行修復(fù)。采用3%雙氧水進(jìn)行孵育10min后分別滴加P53、Ki－67及HER－2抗體，置于4℃環(huán)境下過(guò)夜，采用DAB進(jìn)行顯色，出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。采用蘇木精進(jìn)行復(fù)染3min，用自來(lái)水沖洗，1%的鹽酸酒精進(jìn)行分化，自來(lái)水返藍(lán)5min，置于65℃烤箱烤干，利用中性樹(shù)膠進(jìn)行封片。利用PBS代替第一抗體作為陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照由試劑公司提供。兔抗人Ki－67單克隆抗體、鼠抗人P53單克隆抗體及免疫組化EliVisionTM super試劑盒（兔/鼠）均購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；鼠抗人HER－2單克隆抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。所有試驗(yàn)操作均由檢驗(yàn)科專(zhuān)業(yè)人員嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范進(jìn)行。

1.3 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

P53評(píng)判依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核染色強(qiáng)度：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥75%記4分，51%－74%記3分，26%－50%記2分，≤25%記1分；細(xì)胞核染色呈現(xiàn)棕褐色記3分，棕黃色記2分，談棕色記1分；陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞核染色強(qiáng)度評(píng)分之和：≤1分為（－），2－3分（＋），4－5分（＋＋），≥6分（＋＋＋）；Ki－67評(píng)價(jià)分為三級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為（－），10%－50%為（＋），＞50%為（＋＋），HER－2的評(píng)判采用2011年胃癌 HER－2檢測(cè)指南。本研究結(jié)果由我院2名中級(jí)以上病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料分析采用Spearman秩相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P53、Ki－67和 HER－2表達(dá)情況

P53和Ki－69染色后表達(dá)于細(xì)胞核，被染成棕黃色或棕褐色細(xì)胞顆粒狀，見(jiàn)圖1、2，其陽(yáng)性率分別為61.25%（49/80）和76.25%（61/80）；HER－2表達(dá)于細(xì)胞膜，染色后呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒狀，見(jiàn)圖3，其陽(yáng)性表達(dá)率為28.75%（23/80）。

2.2 P53、Ki－67和 HER－2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

本研究顯示，P53在腫瘤大小、淋巴轉(zhuǎn)移中陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝6.235，4.248，P＜0.05）；Ki－67在腫瘤大小、浸潤(rùn)程度及Dukes分期中陽(yáng)性比達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.222，6.589，5.011，P＜0.05）；HER－2在浸潤(rùn)程度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期中陽(yáng)性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.725，4.296，4.984，P＜0.05）；P53、Ki－67和HER－2在其他病理特征中陽(yáng)性表達(dá)率均無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 CRC P53（＋）細(xì)胞核染色結(jié)果

圖2 CRC Ki－67細(xì)胞核染色結(jié)果

圖3 CRC HER－2（＋）細(xì)胞膜染色結(jié)果

2.3 P53與 Ki－67和 HER－2表達(dá)相關(guān)關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，P53陽(yáng)性表達(dá)與 Ki－67和HER－2陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.231，0.142，P＜0.05），Ki－67陽(yáng)性表達(dá)與 HER－2陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.139，P＜0.05）。

3 討論

CRC是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌，位居第三位。研究顯示［7，8］，RCR的發(fā)病機(jī)制受遺傳和內(nèi)外環(huán)境共同影響，涉及多因素、多步驟及多階段的病理過(guò)程，主要包括組織上皮細(xì)胞分化、增殖、存活和凋亡機(jī)制的紊亂。其中，基因水平的改變是發(fā)病的重要原因。P53是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種與人類(lèi)腫瘤發(fā)生存在高度相關(guān)的基因［9］。目前發(fā)現(xiàn)，P53基因存在野生型和突變型兩種，其中前者存在于人體正常細(xì)胞中，具有抑癌作用，對(duì)細(xì)胞增殖和分裂起到負(fù)調(diào)控作用；突變型不僅喪失了抑癌作用，且獲得了癌基因具有的功能，能夠促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。研究顯示，腫瘤組織中突變型P53表現(xiàn)為高表達(dá)，如相關(guān)研究報(bào)道的胃腸癌中P53蛋白陽(yáng)性率達(dá)20%－60%、結(jié)腸癌P53突變率高于70%等，且其高表達(dá)與腫瘤的惡性程度相關(guān)［10］。

表1 CRC中P53、Ki－67和HER－2表達(dá)與臨床病例特征的關(guān)系

本研究顯示，CRC患者P53基因的陽(yáng)性表達(dá)率為61.25%，與既往研究基本一致［11］。此外，P53在腫瘤大小和淋巴轉(zhuǎn)移分組中陽(yáng)性表達(dá)率存在明顯差異（P＜0.05），說(shuō)明P53高表達(dá)預(yù)示腫瘤組織具有較高的侵襲力和轉(zhuǎn)移能力，可作為預(yù)測(cè)CRC預(yù)后的指標(biāo)。Ki－67是目前標(biāo)志細(xì)胞增殖最可靠和簡(jiǎn)單的方法，Ki－67在細(xì)胞分裂G0期和G1早期一般不表達(dá)，在G1中晚期開(kāi)始表達(dá)然后逐漸升高，M期達(dá)到高峰，可以用于細(xì)胞增殖的定量分析，判斷腫瘤的惡性程度，探討腫瘤組織的浸潤(rùn)方式、生長(zhǎng)方式、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為［12］。研究顯示，多種腫瘤組織中Ki－67高表達(dá)的患者，預(yù)后一般較差。本研究顯示，Ki－67的陽(yáng)性表達(dá)率為76.25%，且在不同腫瘤大小、浸潤(rùn)程度及Dukes分期中Ki－67的陽(yáng)性表達(dá)率存在差異（P＜0.05），說(shuō)明Ki－67較高的陽(yáng)性表達(dá)率代表腫瘤組織增生活躍，容易發(fā)生腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后效果差［13］。HER－2基因在細(xì)胞正常分裂和生長(zhǎng)中起重要的作用，病理情況下其高表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成及提高細(xì)胞侵襲力。此外，HER－2的陽(yáng)性表達(dá)率為28.75%，其在不同浸潤(rùn)程度、淋巴轉(zhuǎn)移及Dukes分期中陽(yáng)性表達(dá)率存在明顯差異（P＜0.05），說(shuō)明HER－2的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞侵襲性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移中存在一定作用，其表達(dá)率越高，腫瘤的侵襲力、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)，患者預(yù)后效果差。

本研究顯示，P53陽(yáng)性表達(dá)與Ki－67和HER－2陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），Ki－67陽(yáng)性表達(dá)與 HER－2陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)（P＜0.05），其原因可能是因?yàn)镻53的生物學(xué)作用是抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，增加疾病進(jìn)展，而Ki－67的表達(dá)在細(xì)胞分裂M期達(dá)到高峰，反映腫瘤細(xì)胞增殖活性，HER－2可以促進(jìn)腫瘤組織新生血管生成及提高細(xì)胞侵襲力，因此，三者均能反應(yīng)疾病的進(jìn)展和惡性程度。而研究報(bào)道HER－2與患者預(yù)后的生存率存在相關(guān)性［14］，因此，較高表達(dá)的P53、Ki－67和HER－2預(yù)示著患者預(yù)后較差，存活率較低。

［1］Gonzalez M，Gervaz P.Risk factors for survival after lung metastasectomy in colorectal cancer patients：systematicreview and meta－analysis［J］.Future Oncol，2015，11（2）：31.

［2］陳 瓊，劉志才，程蘭平.2003－2007年中國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病與死亡分析［J］.中國(guó)腫瘤，2012，21（3）：179.

［3］Yan WF，Wu G，Sun PC，et al.P53mutations occur more commonly than KRAS mutations in colorectal adenoma［J］.Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：1370

［4］McGregor MJ，F(xiàn)adhil W，Wharton R，et al.Aberrant P53Expression Lacks Prognostic or Predictive Significance in Colorectal Cancer：Results from the VICTOR Trial［J］.Anticancer Res，2015，35（3）：1641.

［5］Nakajo M，Nakajo M，Kajiya Y，et al.Correlations of（18）F－fluorothymidine uptake with pathological tumour size，Ki－67and thymidine kinase 1expressions in primary and metastatic lymph node colorectal cancer foci［J］.Eur Radiol，2014，24（12）：3199.

［6］Tu J，Yu Y，Liu W，et al.Significance of human epidermal growth factor receptor 2expression in colorectal cancer［J］.Exp Ther Med，2015，9（1）：17.

［7］Lee DS，Ryu JA，Chung CR，et al.Risk factors for acquisition of multidrug－resistant bacteria in patients with anastomotic leakage aftercolorectal cancer surgery［J］.Int J Colorectal Dis，2015，30（4）：497.

［8］Imbulgoda A，MacLean A，Heine J，et al.Colonic perforation with intraluminal stents and bevacizumab in advanced colorectal cancer：retrospective case series and literature review［J］.Can J Surg，2015，58（2）：13014.

［9］姚宇宙，邢榮春，譚 超，等.結(jié)直腸癌診斷方法的應(yīng)用與評(píng)價(jià)［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（11）：2188.

［10］Jung JH，Kwon HJ，Kim TJ，et al.Immunohistochemical expression of p53，Bcl－2，and Ki－67proteins in traditional serrated adenomas of colon［J］.Korean J Gastroenterol，2013Dec；62（6）：336.

［11］董 亮，錢(qián) 震，施蓉蓉.結(jié)直腸腺癌組織中p53、HER－2和 Ki－67的表達(dá)及其臨床病理意義［J］.診斷病理學(xué)雜志，2015，22（1）：19.

［12］Mrgaritescu C，Pirici D，Cherciu I，et al.CD133/CD166/Ki－67triple immunofluorescence assessment for putative cancer stem cells in colon carcinoma［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2014，23（2）：161.

［13］Day LW，Velayos F.Colorectal cancer screening and surveillance in the elderly：updates and controversies［J］.Gut Liver，2015，9（2）：143.

［14］Guo J，Yang Y，Yang Y，et al.RASSF10suppresses colorectal cancer growth by activating P53signaling and sensitizes colorectal cancer cell to docetaxel［J］.Oncotarget，2015，6（6）：4202.