李 寧，代華平，朱 敏，辛 萍，肖 白

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院－北京呼吸疾病研究所，北京100020；2.首都醫(yī)科大學附屬北京復興醫(yī)院 呼吸科，北京100038）

特發(fā)性間質性肺炎（idiopathic interstitial pneumonia，IIP）是一組發(fā)病原因不明的間質性肺疾病（ILD），以肺實質受到不同形式和程度的炎癥和纖維化損害為特點，特發(fā)性肺纖維化（IPF）是IIP中最常見的一種。目前認為與炎癥損傷及組織修復相關的細胞因子影響了IIP的發(fā)病，其中，腫瘤壞死因子及其受體在介導肺的炎癥和纖維化的過程中起著重要作用。我們應用多聚酶鏈反應－限制性片段長度多態(tài)性 （PCR－RFLP）技術和測序的方法，對中國漢族人群TNFRⅡ196位點多態(tài)性與IIP，特別是與IPF發(fā)病的關系做初步探討。

1 材料與方法

1.1 對象

收集2001.1－2013.12住北京朝陽醫(yī)院呼吸內科確診為特發(fā)性間質性肺炎（IIP）的患者100例，包括：IPF患者83例，均符合中華結核和呼吸雜志2002年發(fā)布《特發(fā)性肺纖維化診斷和治療指南（草案）》IPF臨床診斷標準［1］，其中6例經外科肺活檢確診為普通型間質性肺炎（usual interstitial pneumonia，UIP）；非IPF的IIP患者17例，診斷參考2002年ATS/ERS聯(lián)合發(fā)表的《特發(fā)性間質性肺炎分類》的多學科國際共識意見［2］，其中包括非特異性間質性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）3例，其中1例經外科肺活檢證實；隱源性機化性肺炎（cryopgenic organized neumonia，COP）11例，其中1例經外科肺活檢證實；呼吸性細支氣管炎性間質性肺疾?。╮espiratory bronchiolites－interstitial lung diseases，RB－ILD）3 例。對照組100例，入選標準：與IIP患者1∶1配對的中國漢族人群；性別相同，年齡±2（歲）；吸煙指數(shù)±200（年·支）；且無IIP病史，與IIP患者無血緣關系；主要來自健康體檢者及因急診外傷、骨折等而住院的無慢性疾病的住院病人。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采集外周靜脈血3－5ml，2%EDTA抗凝液抗凝，－20℃低溫保存。用常規(guī)酚－氯仿－異戊醇抽提法提取基因組DNA。

1.2.2 TNFRⅡ196位點基因多態(tài)性分析 按文獻［3］報道的序列合成引物，擴增包含有TNFRⅡ196位點的目的基因片段。TNFRⅡ196位點上游引物：5’－ACTCTCCTATCCTGCCTGCT －3’，下 游引 物：5’－TTCTGGAGTTGGCTGCGTGT －3’。PCR反應總體積為25μl，包括10×PCR反應緩沖液（含 Mg2＋）2.5μl，dNTP mixture 2.0μl，上游引物0.2μl，下游引物 0.2μl，ExTaq DNA 聚合酶0.2μl，DNA 模板1.0μl，ddH2O 18.9μl。

PCR反應條件為：95℃預變性2min，然后95℃變性30s，62℃退火30s，72℃ 延伸30s，40個循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸7min，降至4℃保存。

用2.5%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產物。取PCR擴增產物8μl，與限制性核酸內切酶NlaⅢ1 μl，Buffer緩沖液1μl于37℃條件下消化6－8h，酶解產物經8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.2.3 統(tǒng)計學方法 SPSS19統(tǒng)計軟件整理與分析。IIP組和對照組的年齡、吸煙指數(shù)及吸煙狀態(tài)的差異分別采用t檢驗、秩和檢驗和卡方檢驗?；蛐头植际欠穹?Hardy－Weinberg遺傳平衡定律及兩組間基因型和等位基因頻率的差異比較采用卡方檢驗。TNFRⅡ196位點突變基因型及突變等位基因與IIP、IPF的相對危險度分析采用Logistic回歸計算比值比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）。P＜0.05為差異有顯著性的標準。

2 結果

2.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律檢測

TNFRⅡ196位點的各種基因型在IIP組和對照組人群的分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡，結果有代表性（P＞0.05）。

2.2 IIP組與對照組基本資料的比較

對IIP組和對照組的年齡做t檢驗，吸煙指數(shù)做秩和檢驗，吸煙狀態(tài)做卡方檢驗，結果均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（見表1）。

表1 IIP組（包括IPF和非IPF－IIP）與對照組基本資料的比較

2.3 TNFRⅡ196位點PCR擴增產物的限制性酶切結果

TNFRⅡ196位點的PCR擴增片段大小為242 bp。經NlaⅢ酶切后的PCR產物產生3種基因型，見圖 1。分別為 196M/M（133bp 和 109bp）；196M/R（242bp、133bp、109bp）；196R/R（242 bp）。

2.4 TNFRⅡ196位點基因型、等位基因頻率分析及與發(fā)生IIP、IPF的相對危險度分析（見表2－3）

圖1 TNFRⅡ196位點酶切產物電泳

IIP組與對照組中的196R/R＋196M/R突變基因型和196M/M野生基因型的差異在統(tǒng)計學上無顯著性意義（P＝1.000）；兩組中196R突變型和196M野生型等位基因的差異在統(tǒng)計學上無顯著性意義（P＝0.898）。IPF組與對照組中的196R/R＋196M/R突變基因型和196M/M野生基因型的差異在統(tǒng)計學上無顯著性意義（P＝0.868）；兩組中196R和196M等位基因的差異在統(tǒng)計學上無顯著性意義（P＝1.000）。

TNFRⅡ196位點突變基因型196R/R＋196M/R及突變196R等位基因與IIP及IPF的發(fā)生無顯著相關性。

表2 TNFRⅡ196位點基因型和等位基因在IIP組和對照組的分布及相對危險度分析

表3 TNFRⅡ196位點基因型和等位基因在IPF組和對照組的分布及相對危險度分析

3 討論

近年來，在肺纖維化發(fā)病機制的研究中，多數(shù)學者認為這組疾病是由環(huán)境和遺傳等多種因素共同作用而導致的一類極其復雜的疾病，遺傳因素在其發(fā)病中可能起了重要的作用。它們的易感基因可能包括與上皮細胞損傷和異常損傷修復有關的多個基因多態(tài)性的聯(lián)合作用，故各種細胞因子和表面蛋白基因成為候選基因。最近的研究表明，TNF－α，TGF－β1，IL－4受體拮抗劑等的基因多態(tài)性可能增加肺纖維化 發(fā) 生 的 風 險［4－6］。Pantelidis［5］等 的 研 究 表 明TNFR II和IL－6的基因多態(tài)性與IPF的發(fā)生有顯著相關性。

目前已證實產生于巨噬細胞的細胞因子TNF－α在介導肺的炎癥的和纖維化的過程中起著重要作用。TNF－α可以引起以肺泡上皮細胞和內皮細胞壞死為主的彌漫性肺泡損傷。它是一種前炎癥細胞因子，可誘導血小板活化因子、IL－1、IL－8等致纖維化因子的釋放，抑制肺泡Ⅱ型細胞表面活性物質；并可能間接通過轉化生長因子－β或血小板衍化生長因子誘導途徑促進成纖維細胞增生、分化和膠原轉錄；大量的TNF－α還可誘導肺泡上皮細胞凋亡而引起肺纖維化反應。Liu等［7］發(fā)現(xiàn)，TNF－α不但直接促進纖維化的發(fā)生，而且促進纖維蛋白溶酶原抑制物I的產生，抑制細胞外基質（ECM）降解。研究［8］證實在纖維化的肺部組織中，TNF－α大量增殖，TNF－αmRNA的水平高于正常肺組織。因此認為TNF－α在肺纖維化發(fā)病的過程中是一個關鍵性因子。

在體內，TNF－α的生物學活性必須依賴細胞表面的 TNF受體（TNF receptor，TNFR）來完成。TNF－α/TNFR系統(tǒng)是體內重要的炎癥因子，同時對細菌感染，某些自身免疫疾病和退化性疾病有保護功能，因此，TNFR的生物學活性取決于影響TNF－α/TNFR平衡的諸多因素，并且受遺傳和環(huán)境因素，細胞分化的不同時期以及細胞因子網絡間的信息傳遞等的影響。

TNFR有TNFR I和TNFR II兩種受體。TNFR I參與活化NF－κB，介導細胞凋亡，成纖維細胞增殖等；而TNFR II可通過信號轉導途徑激活NF－κB，傳遞胸腺細胞和NK等淋巴細胞的增殖信號，使細胞增殖和分化。近年研究認為，當細胞表面TNFR2表達上調或過度表達時，TNFR2可直接與腫瘤壞死因子受體相關因子（TRAF2）結合，競爭TNFR1信號轉導通路中的TRAF2分子，TNFR2還通過其適配分子—細胞性凋亡抑制因子－1（CIAP1）引發(fā)TRAF2發(fā)生泛素化及蛋白降解反應，從而增強TNFR1介導的細胞凋亡作用［9］。Erickson的研究［10］顯示TNFRII基因敲除的小鼠對TNF致肺纖維化的敏感性降低，肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖活性明顯被抑制，說明TNFRII在肺纖維化的發(fā)病中起著重要作用。

TNFR I由TNFRSF1A編碼，TNFR II由TNFRSF1B編碼。編碼TNFR II的基因位于染色體1p36，它有許多多態(tài)性位點，其基因多態(tài)性可能影響TNFR II的功能和（或）分泌。TNFRII基因第6外顯子196位點存在T→G堿基的突變（即ATG→AGG），這一突變導致基因產物多肽鏈中的一個甲硫氨酸（methionine，M）被精氨酸（methionine，R）取代，目前推測196G是一個失去功能的置換，其多態(tài)性影響TNFRII的轉錄，直接調控TNFRII的表達量，從而使TNFRII功能異常，可能導致該基因的個體表現(xiàn)過度的免疫反應和過強的凋亡作用；同時，與TNFRII 196T相比，196G對IL－6的合成和分泌有明顯的促進作用，并增加細胞毒性［11］。Till等［12］對TNFRⅡ196R轉染的人類Hela細胞系進行研究，證明TNFRⅡ196位的變異改變了NF－kB信號傳導通路，使TNF－α誘導細胞凋亡的作用增強，導致細胞增生及慢性炎癥性疾病的發(fā)生；從而提示TNFRⅡ196位點的多態(tài)性可能在許多不同的慢性疾病的發(fā)病中起作用。

目前已有多項實驗證實TNFR196位點基因突變與多種慢性病癥易感性相關，如自身免疫性疾病、感染性疾病、惡性腫瘤等疾病的進程及嚴重程度相關。

Cipriano［13］等發(fā)現(xiàn)在社區(qū)獲得性肺炎患者中，攜帶TNFRSF1B＋196TG基因型的患者比攜帶TT或GG基因型患者死亡率低。近年的研究［14］顯示，TNFRII 196位點GG基因型與歐洲人群類風濕性關節(jié)炎（RA）患者存在關聯(lián)。此外，臺灣地區(qū)的CH Tung等人［15］的研究發(fā)現(xiàn) TNFRSF1B＋196T/G的單核苷酸多態(tài)性與強直性脊柱炎的發(fā)病有相關性。結締組織病患者多有多臟器累及，據(jù)報道，其中發(fā)生肺間質病變（CTD－ILD）在臨床診療中并不少見。目前其發(fā)病機理不明，可能與血管炎有關，血管壁的免疫復合物激活補體釋放中性粒細胞趨化因子，導致中性粒細胞在局部聚集釋放膠原酶及氧自由基，破壞肺實質，造成肺泡炎，而晚期逐漸進展為肺纖維化病變。目前認為，不同結締組織病所致肺間質病變的機理各有不同，但細胞因子在其纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，如IL－1、IL－8、TGF－β1、TNF－α、胰島素樣生長因子－α（IGF－α）等［16］，故它可能與IIP存在著共同的病理特點和致病基因。而國內李霖等［17］的研究認為TNFRⅡ196位點的基因多態(tài)性與中國漢族人群矽肺的發(fā)病可能無關。

目前TNFRII基因196位點多態(tài)性與IIP、IPF相關性的報道較少。本研究結果提示了中國漢族人群中TNFRⅡ196位點基因多態(tài)性可能與IIP，特別是與IPF的發(fā)生無關聯(lián)，但尚需做進一步研究證實。

本研究結果表明中國漢族人群中TNFRII 196位點基因多態(tài)性可能與IIP、IPF的發(fā)生無關聯(lián)。但是本實驗也存在一定的局限性：本研究中非IPF－IIP患者較少，故未能做非IPF組與IPF組的比較，因此今后需要擴大樣本量進行研究；另外，還需對IIP的環(huán)境危險因素及遺傳因素進行交互作用分析等研究工作，以期為IIP疾病的早期預防、早期發(fā)現(xiàn)及早期治療提供科學依據(jù)。

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