汪 莉，鐘素蘭，尹仕海

(1.雙流縣第一人民醫(yī)院口腔科，四川成都610200;2.廣東省口腔醫(yī)院南方醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣東廣州510280;3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，四川成都610041)

髓腔穿孔(perforation)是病理性或醫(yī)源性導(dǎo)致的髓腔與牙周組織非生理性的通道，極易導(dǎo)致牙周組織炎癥，如穿孔處牙槽骨吸收、肉芽組織形成和竇道;如果不及時修復(fù)或修復(fù)方法及材料使用不當(dāng)，可顯著影響根管治療效果，最終可能導(dǎo)致患牙的拔除。因此，及時、有效地修復(fù)髓腔穿孔是根管治療術(shù)過程中的重要環(huán)節(jié)。

用于髓腔穿孔修復(fù)的材料種類較多。傳統(tǒng)修復(fù)材料有銀汞合金［1］、復(fù)合樹脂［2］、玻璃離子［3］等;頗受口腔醫(yī)生歡迎的生物性穿孔修復(fù)材料有，上世紀(jì)九十年代末推出的三氧化礦物凝聚體(Mineral Trioxide Aggregate，MTA)，以及近年應(yīng)用于臨床的iRoot生物陶瓷材料［4］。

髓腔穿孔修復(fù)材料應(yīng)具有良好的生物相容性，對牙周組織無刺激性和無毒性，能誘導(dǎo)骨或牙骨質(zhì)形成，能促進(jìn)牙周組織的修復(fù)再生。生物安全性是髓腔穿孔修復(fù)材料的最重要性能，研究細(xì)胞在材料表面的黏附狀況和形態(tài)變化是觀察細(xì)胞生物相容性的基本手段。本課題組前期實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR法研究了銀汞合金、FiltekTMZ350納米復(fù)合樹脂、MTA等3種常用的髓腔穿孔修復(fù)材料對人牙周膜成纖維細(xì)胞堿性磷酸酶和骨鈣素mRNA表達(dá)的影響［5］，本研究在倒置相差顯微鏡下觀察這3種材料對人牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響，并在掃描電鏡下觀察3種材料表面人牙周膜成纖維細(xì)胞的附著及伸展情況，為臨床選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試件制備

根據(jù)穿孔修復(fù)材料的不同將實(shí)驗(yàn)分為4組，A組:MTA(Densply，美國);B組:Z350(3M，美國);C組:銀汞合金(上海齒科材料廠);D組:(空白對照)載玻片。A、B、C、D組分別按使用說明將穿孔修復(fù)材料制備成直徑為5.0 mm，高為2.5 mm的圓柱體，表面不經(jīng)過打磨拋光程序。將4組試件用紫外線消毒30 min備用。

1.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)

將臨床上因正畸減數(shù)拔除的前磨牙(牙周健康，無齲損及根尖周炎)即刻放入無血清的DMEM培養(yǎng)基中，用含有抗生素(青霉素100 μg/mL、鏈霉素100 μg/mL)的PBS反復(fù)沖洗;刮取根中1/3牙周膜組織均勻鋪在6孔板的底面，覆蓋玻片，加入含200 mL/L FCS的DMEM培養(yǎng)基。待原代細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板底70%左右后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代。取第6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 方法

1.3.1 倒置相差顯微鏡觀察

取對數(shù)生長期的第6代人牙周膜成纖維細(xì)胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化，加入用含200 mL/L的DMEM培養(yǎng)基，充分吹打，使之成為單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×105/mL。取4組標(biāo)本各4個放入6孔板中，每孔加入1×105/mL的細(xì)胞懸液 2 mL，37 ℃、50 mL/L CO2、950 mL/L O2、100%濕度培養(yǎng)24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察材料周邊及載玻片上細(xì)胞形態(tài)的變化，倒置顯微鏡照相(Leica DMI 6000B，德國)。

評價方法:①計(jì)算材料和細(xì)胞之間無細(xì)胞帶的面積［6］，數(shù)據(jù)以表示，②細(xì)胞形態(tài)評價標(biāo)準(zhǔn)［6］:1級，少量細(xì)胞皺縮(＜10%);2級，部分細(xì)胞皺縮(＜50%);3級，大量細(xì)胞皺縮(＜90%);4級，大量細(xì)胞死亡(＜10%細(xì)胞存活)。

1.3.2 掃描電鏡觀察

將上述細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的材料在30 mL/L的戊二醛中固定2 h，乙醇梯度脫水各15 min，醋酸異戊酯室溫置換15 min。臨界點(diǎn)干燥、噴金，JSE-5900LV掃描電鏡觀察。

細(xì)胞形態(tài)評價標(biāo)準(zhǔn)同1.3.1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件對不同材料和細(xì)胞之間的無細(xì)胞帶結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果

3種材料與人牙周膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，牙周膜成纖維細(xì)胞成梭形，增殖并貼附于載玻片。倒置相差顯微鏡下可見MTA組無細(xì)胞帶面積最小(0.75±0.15)mm2，材料周圍細(xì)胞形態(tài)好，細(xì)胞形態(tài)評為1級;Z350組無細(xì)胞帶面積略大(3.58±0.36)mm2，材料周圍少量細(xì)胞皺縮，細(xì)胞分級形態(tài)為2級;銀汞合金組材料周圍有明顯的無細(xì)胞帶，且面積最大(8.88±0.90)mm2，細(xì)胞多為圓形，細(xì)胞形態(tài)分級為4級。3組兩兩相比，無細(xì)胞帶面積有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)(圖1)。

2.2 掃描電鏡結(jié)果

3種材料與人牙周膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，掃描電鏡下觀察材料表面細(xì)胞形態(tài)可以發(fā)現(xiàn)，MTA表面細(xì)胞黏附較多，形態(tài)良好，細(xì)胞分級為1級;Z350表面細(xì)胞黏附較少，細(xì)胞分級為2級;銀汞合金表面細(xì)胞黏附最少，細(xì)胞分級為4級(圖2)。

圖1 24 h后3種材料周圍的細(xì)胞形態(tài)(PM，×200)

圖2 培養(yǎng)24 h后不同材料表面細(xì)胞形態(tài)(SEM)

3 討論

細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能有著重要聯(lián)系。細(xì)胞形態(tài)完整除了有利于細(xì)胞的支持和保護(hù)外，還是整個細(xì)胞的行為、生理活動、相互識別、粘著、物質(zhì)運(yùn)輸、信息傳導(dǎo)、生長分化的基礎(chǔ)。形態(tài)學(xué)觀察是研究材料與細(xì)胞相互關(guān)系最基本的內(nèi)容，研究材料對細(xì)胞形態(tài)的影響是評價材料生物相容性的方法之一［7-8］。

觀察細(xì)胞形態(tài)的變化多采用直接接觸法，即將細(xì)胞直接放在生物材料上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)有毒性物質(zhì)釋放時，細(xì)胞可發(fā)生形態(tài)變化和數(shù)量增減，以此來檢測細(xì)胞毒性程度，同時可以直接觀察到細(xì)胞在材料表面黏附情況。

本結(jié)果顯示，3種材料對牙周膜成纖維細(xì)胞的形態(tài)都有一定影響。倒置相差顯微鏡下觀察，正常牙周膜成纖維細(xì)胞貼壁后開始伸展，多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或星形，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓形或卵圓，核仁清晰，可見核分裂相。3種髓腔穿孔修復(fù)材料與人牙周膜成纖維細(xì)胞共同培養(yǎng)1 d后，相差顯微鏡下觀察，銀汞合金組材料周圍有明顯的無細(xì)胞帶，低倍鏡下見90%以上的細(xì)胞皺縮成圓形，細(xì)胞極少保留梭形;高倍鏡下見大部分細(xì)胞為不規(guī)則圓形，胞漿少，未見明顯核仁及核分裂相，顯示為較大材料毒性作用后的細(xì)胞特征［9］。Z350組無細(xì)胞帶面積低于銀汞合金，且低于50%細(xì)胞皺縮。而MTA組無細(xì)胞帶面積最小，與前兩組相比有顯著差異，且細(xì)胞皺縮小于10%，對細(xì)胞形態(tài)影響較小。掃描電鏡下觀察，銀汞合金表面附著細(xì)胞少，且多為皺縮，細(xì)胞伸展少;Z350表面附著的細(xì)胞增多，細(xì)胞鋪展，多個偽足樣突起緊密黏附在材料表面，但是有少量細(xì)胞胞體較正常者小，有少量細(xì)胞皺縮;MTA表面細(xì)胞附著多，形態(tài)良好，大量細(xì)胞鋪展，排列成網(wǎng)狀，細(xì)胞突起相互連接，細(xì)胞上附大量微小囊泡。

本結(jié)果表明，銀汞合金對牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響最大。Zhu等［6］研究了幾種材料對牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)銀汞合金周圍的無細(xì)胞帶比IRM(Intermediate Restorative Material，中間修補(bǔ)材料))及Super-EBA(Super-EBA(Super Ethoxybenzoic Acid，超級苯乙基安息香酸)大;Mitchell等［10-11］發(fā)現(xiàn)MTA對MG63細(xì)胞株形態(tài)的影響較小，與本結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)中，MTA對細(xì)胞形態(tài)的影響最小，材料周圍的無細(xì)胞帶面積最小，材料表面黏附細(xì)胞多，形態(tài)良好。細(xì)胞在MTA表面黏附較好，繼而增殖，并形成新的牙骨質(zhì)、牙槽骨，才能達(dá)到真正意義上的牙周組織再生［12］。

MTA是由硅酸三鈣、鋁酸三鈣、氫氧化鈣等無機(jī)物組成，具有良好的生物相容性，但是，因其操作性能較差、放置材料費(fèi)時、不利于提高臨床工作效率等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了其在臨床上的使用。近年來，臨床上又出現(xiàn)了多種可用于髓腔穿孔修復(fù)的新材料，如 BioAggregate(BA)［13］、iRoot BP等［14］。BA在MTA基礎(chǔ)上合成，主要含有硅酸三鈣、硅酸二鈣、氫氧化鈣等無機(jī)物，與MTA相似。BA中不含有鋁元素，可進(jìn)一步降低對人體的毒害，對人牙周膜成纖維細(xì)胞的毒性較MTA低［15］，具有良好的生物相容性。BA與MTA都能誘導(dǎo)細(xì)胞堿性磷酸酶及骨鈣素的表達(dá)，具有相似的生物活性，但BA的黏結(jié)性差于MTA。生物陶瓷材料iRoot BP具有良好的生物相容性，化學(xué)性能穩(wěn)定，易于操作，且微滲漏小于MTA，具有良好的封閉效果，但是其對細(xì)胞的分化及成骨性能的影響還有待研究。目前尚缺乏臨床髓腔穿孔修復(fù)材料修復(fù)后長期的效果評價，如材料的封閉能力如何，是否會發(fā)生微生物再感染，牙齒強(qiáng)度及抗折性能如何等等。

本結(jié)果顯示，MTA對人牙周膜成纖維細(xì)胞形態(tài)的影響最小，最易于細(xì)胞黏附，同時具有良好的生物相容性，是目前修復(fù)髓腔穿孔材料的較好選擇。

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