余方方，葉 新，陳 棟，范 云，李 瑋

(河南鄭州:1.鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，450052;2.鄭州頤和醫(yī)院口腔科，450008)

苯妥英鈉(Phenytoin，PHT)是傳統(tǒng)的抗癲癇藥物，因發(fā)現(xiàn)其有導(dǎo)致牙齦增生的不良反應(yīng)，一直進(jìn)行其對(duì)創(chuàng)面愈合促進(jìn)作用的實(shí)驗(yàn)及臨床研究?？垢腥竞蛣?chuàng)面愈合相輔相成，都是創(chuàng)面治療要解決的關(guān)鍵問題。研究表明，苯妥英鈉對(duì)體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用［1］。PHT局部用藥在創(chuàng)傷愈合中的積極作用也被許多臨床病例所驗(yàn)證，例如糖尿病足潰瘍、創(chuàng)傷、褥瘡性潰瘍、靜脈淤積性潰瘍等［2］。類毒素(lipopolysaccharide，LPS)是牙周病的主要致病物質(zhì)，能抑制牙周膜成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)牙周膜成纖維細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α等炎性因子［3-4］。本實(shí)驗(yàn)通過觀察PTH對(duì)LPS作用下人牙周膜成纖維細(xì)胞(hPDLFs)增殖和表達(dá)TNF-α的影響，以探討其對(duì)牙周炎癥的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(杭州四季青);DMEM培養(yǎng)基(Hyclone，美國);PHT(阿拉丁，上海晶純);E.coli LPS、MTT(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司);鼠抗人波形絲蛋白單克隆抗體、鼠抗人角蛋白單克隆抗體(北京中杉金橋);TNF-α單克隆抗體(武漢博士德);SP免疫組化染色試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京博奧森);倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本);酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國)。

1.2 hPDLFs的培養(yǎng)和鑒定

牙周膜組織取材于河南省口腔醫(yī)院收治的12～18歲因正畸需要而拔除的牙周健康、無齲損的新鮮前磨牙(均知情同意)，并采用酶消化組織塊法原代培養(yǎng)hPDLFs;待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%后，常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3代時(shí)，用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法進(jìn)行波形絲蛋白和角蛋白單克隆抗體染色，確定其為中胚層間充質(zhì)來源的細(xì)胞后，取第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 LPS溶液和PHT溶液的配制

PHT溶液的配制:將0.125 g分析純苯妥英鈉溶于50 mL含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基中，制成濃度為2 500 mg/L的儲(chǔ)存液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過濾除菌后，再用含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成5、20 mg/L濃度，4℃保存?zhèn)溆谩PS溶液配制:取 10 mg LPS溶于 50 mL含20 mL/L FBS的 DMEM培養(yǎng)基中，制成為200 mg/L的儲(chǔ)存液。經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌后，再用含20 mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基稀釋成100 mg/L，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第5代hPDLFs，以1×104/孔接種于96孔板(每孔100 μL)，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞隨機(jī)分為6組(每組復(fù)6孔):正常對(duì)照組(含 20 mL/L FBS的 DMEM培養(yǎng)基基)、100 mg/L LPS組、5 mg/L PHT組、20 mg/L PHT組、100 mg/L LPS+5 mg/L PHT組、100 mg/L LPS+20 mg/L PHT;然后按上述分組分別加入含不同藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后每孔加入20 μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，并用倒置顯微鏡觀察結(jié)晶形成情況;然后小心吸棄孔內(nèi)上清液，并于每孔中各加入150 μL DMSO，置于恒溫振蕩器上震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值(A值)。

1.5 TNF-α的免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第5代細(xì)胞以1×105/mL接種于4塊有蓋玻片的6孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后吸棄原培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，并將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:正常對(duì)照組、20 mg/L PHT組、100 mg/L LPS組、100 mg/L LPS+20 mg/L PHT組(每組復(fù)6孔);然后按上述分別加入相應(yīng)的含不同藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)各組細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)情況(以PBS代替一抗作為空白對(duì)照)并拍照;然后用ImageJ軟件對(duì)各組圖片的灰度值進(jìn)行檢測(cè)，每張圖片各測(cè)6個(gè)不同的區(qū)域取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hPDLFs的形態(tài)學(xué)觀察和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

原代培養(yǎng)的hPDLFs呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，胞核圓或卵圓，胞質(zhì)均勻，有2～3個(gè)細(xì)長(zhǎng)形突起，放射狀或旋渦狀排列生長(zhǎng)，呈典型的成纖維細(xì)胞樣。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，抗波形絲蛋白抗體呈陽性(胞質(zhì)呈棕黃色)，抗角蛋白抗體呈陰性(胞質(zhì)不著色)，證明所培養(yǎng)細(xì)胞屬于間充質(zhì)來源(圖1)。

2.2 細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)結(jié)果

MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，20 mg/L PHT可明顯促進(jìn)hPDLFs的增殖(P＜0.05)，100 mg/L LPS可明顯抑制hPDLFs的增殖(P＜0.05);而100 mg/L LPS+20 mg/L PHT時(shí)則可明顯逆轉(zhuǎn)LPS對(duì)hPDLFs增殖的抑制作用(P＜0.05);5 mg/L PHT組分別與正常對(duì)照組和20 mg/L PHT組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);100 mg/L LPS+5 mg/L PHT組與單純100 mg/L LPS組相比差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)(表1)。

圖1 hPDLFs的鑒定結(jié)果(SP，×400)

表1 不同濃度PHT對(duì)LPS作用下hPDLFs增殖活性的影響 (n=6)

2.3 TNF-α的免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)

各組hPDLFs中TNF-a的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果均表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)棕黃色著色，胞核無著色，但不同藥物組的染色強(qiáng)度不盡相同:正常對(duì)照組和20 mg/L PHT組的細(xì)胞質(zhì)呈淺黃色，100 mg/L LPS組和100 mg/L LPS+20 mg/L PHT組的細(xì)胞質(zhì)呈深棕色。采用Imaget圖像分析軟件對(duì)各組的灰度值進(jìn)行分析顯示，灰度值由高到低依次為:20 mg/L PHT組＞正常對(duì)照組＞100 mg/L LPS+20 mg/L PHT組＞100 mg/L LPS組;各組間兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?；叶戎翟酱螅f明其TNF-α蛋白的表達(dá)程度越弱;灰度值越小，說明其TNF-α蛋白的表達(dá)程度越強(qiáng)(表2，圖2)。

表2 不同濃度PHT對(duì)LPS作用下hPDLFs中TNF-α表達(dá)的影響 (n=6)

圖2 各組hPDLFs中TNF-α的表達(dá)(SP，×400)

3 討論

LPS是G-厭氧菌所獨(dú)有的一種致病物質(zhì)，具有高度生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性，對(duì)牙周組織具有很強(qiáng)的毒性和抗原作用。高濃度LPS能夠損傷牙周膜細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖［5］。張 鳳 秋 等［3-4］研 究 表 明，LPS 濃 度 為10 mg/L、100 mg/L時(shí)可明顯抑制牙周膜細(xì)胞的生長(zhǎng)，并刺激牙周膜細(xì)胞分泌TNF-α;100 mg/L的LPS作用于牙周膜細(xì)胞24 h即可明顯抑制牙周膜細(xì)胞增殖，有效刺激牙周膜細(xì)胞分泌TNF-α。鑒于各種不同種屬G-菌的主要活性成分類脂A極為相似，故本實(shí)驗(yàn)選用具有代表性的大腸桿菌LPS用于實(shí)驗(yàn)，并以100 mg/L的濃度作用24 h。

TNF-α是成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等產(chǎn)生的一種具有廣泛生物學(xué)作用的多功能細(xì)胞因子，在復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用。張鳳秋等［4］研究發(fā)現(xiàn)，人PDLC在受到LPS刺激時(shí)能分泌IL-6、IL-1β、IL-8和TNF-α等炎癥因子。其中TNF-α與牙槽骨吸收密切相關(guān)，因此，抑制TNF-α的分泌對(duì)牙周炎的防治具有重要意義。

Shapiro等［6］(1958)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，口服 PHT的牙周病患者接受牙周手術(shù)后，其手術(shù)創(chuàng)口很少有炎癥和疼痛感，且愈合速度較對(duì)照組明顯加快，說明PHT有明顯的促愈合作用。有學(xué)者認(rèn)為，PHT促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制可能與其刺激成纖維細(xì)胞增殖、加快創(chuàng)面肉芽組織形成、減少膠原酶活性、減輕創(chuàng)面的細(xì)菌感染有關(guān)［7］。

Craner等［8］報(bào)道，PHT可以減輕小鼠的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎的炎癥反應(yīng)。Serra等［9］通過檢測(cè)PHT及其代謝產(chǎn)物對(duì)LPS激發(fā)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生MMP、TIMP、TNF-α、IL-6的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，PHT 及其代謝產(chǎn)物5-(p-hydroxyphenyl-)、5-phenylhydantoin(HPPH)均可阻止炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，說明PHT具有抗炎作用。除此之外，于美嬌、楊丕山等［1］還發(fā)現(xiàn)，5 ～100 mg/L PHT 可以促進(jìn) hPDLFs的增殖。故本實(shí)驗(yàn)選取PHT質(zhì)量濃度分別為5、20 mg/L的PHT作用于 hPDLFs，以探討其對(duì) LPS作用下hPDLFs增殖和炎性因子TNF-α表達(dá)的影響，以期為PHT用于消除牙周炎癥提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)分別采用MTT法和免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)PHT對(duì)LPS作用下hPDLFs增殖和TNF-α表達(dá)的影響。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，20 mg/L的PHT可以明顯促進(jìn) hPDLFs增殖，并可明顯逆轉(zhuǎn)LPS對(duì) hPDLFs增殖的抑制作用。因此，選擇質(zhì)量濃度為20 mg/L的PHT用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測(cè)結(jié)果顯示:20 mg/L的PHT不僅具有直接抑制hPDLFs表達(dá)TNF-α的作用，還具有阻止LPS介導(dǎo)hPDLFs表達(dá)TNF-α的作用。

PHT不僅具有抗癲癎、抗心律失常等作用，還可以影響Na+和Ca2+的代謝。有研究發(fā)現(xiàn)，Na+通道與激活巨噬細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)［8］。更進(jìn)一步的研究表明，Na+通道阻滯劑可以有助于調(diào)節(jié)免疫功能［10］。在小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，用PHT阻斷Na+通道可以明顯減少 LPS誘導(dǎo)的IL-1α、IL-1β和TNF-α的釋放，表明Na+通道參與細(xì)胞因子的釋放過程［11］。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，一定濃度的PHT可以影響LPS作用下 hPDLFs內(nèi)炎癥因子TNF-α的表達(dá)，說明Na+通道阻滯劑PHT可能與細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放有相關(guān)性。

綜上所述，PHT具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和抗炎作用，但由于細(xì)胞因子之間是通過復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮作用的，關(guān)于PHT在牙周病治療中的應(yīng)用前景尚需繼續(xù)深入的研究。

［1］于美嬌，楊丕山，葛少華.苯妥英鈉對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，26(2):215-217.

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