張欣然，劉 翠，朱 彪，張玉成，郭希民，郭紅延

(北京:1.北京武警總醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心，100039;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所全軍細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100850)

組織工程和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，為牙周組織的再生提供了新的思路。種子細(xì)胞是其關(guān)鍵因素之一，其中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其具有多項(xiàng)分化潛能，且來(lái)源豐富、易于獲得，越來(lái)越受到重視［1］。腫瘤壞死因子 -α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為牙周病發(fā)病過(guò)程中造成組織破壞的主要炎癥因子［2-3］，可刺激成骨細(xì)胞的凋亡［4］，并抑制其骨形成作用。然而TNF-α是否因?yàn)榭烧T導(dǎo)BMSCs的凋亡，從而影響其移植后的增殖及分化目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在探討不同濃度TNF-α刺激條件下，大鼠BMSCs發(fā)生凋亡的情況及其凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

SPF級(jí)SD大鼠(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó));地塞米松、β-磷酸甘油、抗壞血酸、異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、吲哚美辛、胰島素(西南藥業(yè)公司);20 mL/L硝酸銀、50 mL/L硫代硫酸鈉水溶液、油紅 O/異丙醇飽和液、四甲基偶氮唑藍(lán)鹽(MTT)(重慶化學(xué)試劑總廠(chǎng));TNF-α(Sigma，美國(guó));Bcl-2、Bax、β-actin 一抗(Santa Cruz，美國(guó));辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(北京中杉金橋);BCA蛋白定量試劑盒、Tunel檢測(cè)試劑盒(北京碧云天);PVDF膜(millipore，美國(guó));ECL發(fā)光試劑盒(北京普利萊);電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Red，美國(guó));倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 大鼠BMSCs的培養(yǎng)和鑒定

1.2.1 大鼠BMSCs的分離和培養(yǎng)［5］

取3～4周齡雄性SD大鼠，脫頸處死后置于750 mL/L的乙醇中浸泡消毒10 min;無(wú)菌條件下分離取出股骨、脛骨，分別剪去其兩端骨組織后，用α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基沖出骨髓，并將其轉(zhuǎn)移至含α-MEM培養(yǎng)液(含100 mL/L的胎牛血清以及100 U/mL青霉素、鏈霉素)的培養(yǎng)皿中;反復(fù)吹打至無(wú)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)塊后，置于37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天首次換液，而后每?jī)商彀肓繐Q液，并用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80% ～90%融合時(shí)，吸棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次后，用2.5 g/L胰酶消化3 min;加入等體積α-MEM培養(yǎng)液終止消化后，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，傳至第3代時(shí)即可得到較純的大鼠BMSCs。

1.2.2 大鼠BMSCs的鑒定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs分別向成骨細(xì)胞和成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化［6］，并進(jìn)行染色鑒定［7］。成骨誘導(dǎo):常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁達(dá)70%以上時(shí)，換用成骨誘導(dǎo)液(含0.1 μmol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油、50 mg/L抗壞血酸、100 mL/L FBS的α-MEM)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后行堿性磷酸酶染色，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d后行茜素紅染色，并分別在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察和拍照。成脂誘導(dǎo):常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁達(dá)70%以上時(shí)，換用成脂誘導(dǎo)液(含 0.25 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L 胰島素、100 mL/L FBS的α-MEM)進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d后行油紅O染色，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并拍照。

1.3 TNF-α誘導(dǎo)BMSCs凋亡的實(shí)驗(yàn)觀察

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和處理

取第3代BMSCs傳代后以1×105/mL的密度接種于置有蓋玻片的6孔板中，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底70% ～80%時(shí)，棄原培養(yǎng)液，并將細(xì)胞隨機(jī)分為 A、B、C 3組;分別加入含鼠源性TNF-α 終濃度為 0 μg/L(A 組)、20 μg/L(B 組)、40 μg/L(C組)的α-MEM繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，胰酶消化并收集各組細(xì)胞，分別進(jìn)行以下檢測(cè)。

1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)

取上述培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，用4 mL/L臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行染色(9滴細(xì)胞懸液加1滴臺(tái)盼藍(lán))后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別計(jì)各組的活細(xì)胞數(shù)(未著色細(xì)胞)和死細(xì)胞數(shù)(著色細(xì)胞)，并按以下公式計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.3.3 Tunel染色觀察

取上述培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，用PBS洗滌2次后每孔中各加入2 mL 40 g/L的多聚甲醛，室溫下固定30 min;PBS洗滌3次(每次3 min)，用1 g/L的Triton-X100處理細(xì)胞，并進(jìn)行Tunel標(biāo)記;PBS沖洗2次后，每孔滴加50 μL/L Tunel反應(yīng)混合液，37℃避光孵育1 h;PBS洗滌3次，用抗熒光猝滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察并拍照。染色后呈紅色熒光者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)各組的凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，并按以下公式計(jì)算其凋亡指數(shù)。

1.3.4 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)水平

取上述培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞，PBS沖洗兩遍后，每孔中各加入150 μL濃度為 10 mL/L的PMSF的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，并提取總蛋白。用BCA試劑盒對(duì)各組總蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)后，取等量樣品以120 mL/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用50 g/L的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別滴加Bcl-2，Bax，β-actin一抗封閉過(guò)夜后，再以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗封閉2 h;ECL發(fā)光試劑盒顯色，掃描并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BMSCs細(xì)胞培養(yǎng)和鑒定

倒置顯微鏡觀察可見(jiàn)，原代培養(yǎng)的大鼠BMSCs呈梭形或不規(guī)則的多邊形，可貼壁生長(zhǎng)，并有若干集落形成(生長(zhǎng)形態(tài)類(lèi)似于旋渦狀)。第3代BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)14、21 d后，分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色及茜素紅染色，其結(jié)果均為陽(yáng)性(圖1a、b);經(jīng)成脂誘導(dǎo)14 d后，可見(jiàn)脂滴形成(圖1c)，油紅O染色結(jié)果為陽(yáng)性(圖1d)。

圖1 BMSCs成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定結(jié)果(×100)

2.2 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜，并通過(guò)與解體的DNA結(jié)合而使其著色(藍(lán)染);而活細(xì)胞因能阻止臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，故不著色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，20、40 μg/L的 TNF-α 均能明顯降低 BMSCs的細(xì)胞活性，分別與0 μg/L相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);其中以40 μg/L組的細(xì)胞活性降低最明顯，與20 μg/L組相比，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖2)。

2.3 Tunel染色觀察結(jié)果

熒光顯微鏡下可見(jiàn)，凋亡細(xì)胞呈紅色熒光，并隨著TNF-α濃度的升高，紅色熒光率逐漸增加(圖3)。各組細(xì)胞的凋亡率以40 μg/L組最高，0 μg/L組最低，各組間兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。

圖2 不同濃度TNF-α對(duì)BMSCs細(xì)胞活力影響的比較

圖3 各組BMSCs經(jīng)Tunel染色后熒光顯微鏡觀察(箭頭示凋亡細(xì)胞)(×200)

圖4 各組BMSCs的凋亡率比較

2.4 各組BMSCs中Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)變化

Western Blot結(jié)果顯示，隨TNF-α濃度的升高，BMSCs中的Bax蛋白表達(dá)量逐漸增加，Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少;各組間兩兩相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖5～6)。

圖5 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

圖6 各組BMSCs中Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)的比較

3 討論

當(dāng)下，組織工程與再生醫(yī)學(xué)發(fā)展迅速，基于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的多項(xiàng)分化潛能，各種組織來(lái)源的MSCs都可以作為組織工程的種子細(xì)胞［8］;特別是骨髓來(lái)源的 MSCs，因其來(lái)源豐富、取材簡(jiǎn)單、分化潛能好，且具有較好的免疫原性，臨床應(yīng)用前景非常廣闊［9］。在牙周組織再生的過(guò)程中，BMSCs位于其特定的微環(huán)境中，這種微環(huán)境可能會(huì)影響細(xì)胞的存活，從而使細(xì)胞治療的效果大大降低并限制其應(yīng)用。

牙周病是造成牙周組織破壞的主要疾病，而TNF-α則是牙周病發(fā)生過(guò)程中重要的介導(dǎo)因子。TNF-α可通過(guò)刺激其他炎癥介質(zhì)和黏附分子、趨化因子的產(chǎn)生，促進(jìn)IL-6、前列腺素E、膠原酶等的合成，從而促進(jìn)結(jié)締組織的破壞［10］，促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性、抑制成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)骨吸收［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在牙周病患者的齦溝液及牙齦組織中存在著大量的TNF-α，移植后的BMSCs處于此種微環(huán)境中，其活性可能也會(huì)受到影響。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外研究不同濃度的TNF-α對(duì)BMSCs的活性、凋亡狀況的影響及其凋亡過(guò)程中凋亡相關(guān)基因的表達(dá)變化，為日后BMSCs在牙周組織再生中的更好應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的大鼠BMSCs經(jīng)成骨、成脂鑒定，結(jié)合其形態(tài)學(xué)觀察和貼壁生長(zhǎng)特性［11］，均提示其具有較高的純度和多項(xiàng)分化潛能。以 0、20、40 μg/L的TNF-α分別作用于大鼠BMSCs 24 h后，臺(tái)盼藍(lán)染色和Tunel染色結(jié)果顯示，隨著TNF-α濃度的增加，BMSCs的活性逐漸下降、凋亡率逐漸增加，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的TNF-α均可誘導(dǎo)BMSCs的凋亡。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，各種凋亡刺激因素均可通過(guò)外源性的途徑與細(xì)胞表面的凋亡受體結(jié)合，或通過(guò)內(nèi)源性途徑使線(xiàn)粒體釋放氧自由基，從而引起細(xì)胞凋亡［12］。Bcl-2主要通過(guò)抑制線(xiàn)粒體釋放促凋亡蛋白，而抑制細(xì)胞凋亡、延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命［13］;在細(xì)胞接受凋亡刺激后，Bcl-2可通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換孔來(lái)改變線(xiàn)粒體膜的通透性，并阻止Cyt-c的釋放，從而發(fā)揮其抗凋亡的作用［14］。Bax是Bcl-2家族中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的成員，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡刺激時(shí)，Bax從胞液遷移到線(xiàn)粒體膜和核膜上，并在線(xiàn)粒體外膜上形成通道介導(dǎo)Cyt-c的釋放，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡［15］。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨 TNF-α 濃度的增加，抗凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)量逐漸下降，Bax的蛋白表達(dá)量逐漸上升，且細(xì)胞凋亡增加。以上結(jié)果提示，TNF-α引起的細(xì)胞凋亡與Bcl-2表達(dá)量降低和Bax表達(dá)增高有關(guān)。

在牙周病的治療中，BMSCs的再生能力雖為其開(kāi)辟了新的途徑，但由于上述組織破壞中會(huì)產(chǎn)生包括TNF-α在內(nèi)的大量炎性因子，從而會(huì)造成移植細(xì)胞的凋亡，并阻止其增殖分化，最終影響組織的再生。因此，要實(shí)現(xiàn)牙周組織的成功再生，必須阻止這些炎性分子的作用，從而提高BMSCs用于移植時(shí)的細(xì)胞存活率。

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