王紅　萬喆　余進(jìn)（北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京100034）

波氏假阿利什霉復(fù)合種對4種抗真菌藥物的敏感性研究

王紅萬喆余進(jìn)
（北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心皮膚病分子診斷北京市重點實驗室，北京100034）

目的對23株分子鑒定為賽多孢霉復(fù)合種的菌株檢測其對伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和兩性霉素B的敏感性。方法參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所制定的M38?A2方案，檢測臨床來源的9株波氏假阿利什霉（Pseudallescheria boydii）、6株P(guān)．ellipsoidea、1株P(guān)．a(chǎn)ngusta、1株P(guān)．fusoidea和6株尖端賽多孢（Scedosporium apiospermum）對伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和兩性霉素B的MIC值。結(jié)果伏立康唑?qū)λ惺茉嚲甑腗IC值為0．25～1 μg／mL，泊沙康唑為2～4 μg／mL。伊曲康唑?qū)．ellipsoidea、尖端賽多孢的MIC值為2～＞16 μg／mL，對波氏假阿利什霉、P．a(chǎn)ngusta、P．fusoidea的MIC值為2～4 μg／mL。兩性霉素B對5種菌的MIC值均為為4～＞16 μg／mL。結(jié)論伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑和兩性霉素B對波氏假阿利什復(fù)合種中不同種的敏感性未見明顯差異。該復(fù)合種對伏立康唑最敏感，泊沙康唑其次，伊曲康唑變化較大，兩性霉素B的效果最差。

波氏假阿利什霉復(fù)合種；伏立康唑；泊沙康唑；伊曲康唑；兩性霉素B

［Chin J Mycol，2015，10（2）：96?99］

賽多孢霉是近年來臨床逐漸增多的一種條件致病性真菌。賽多霉感染多見于惡性腫瘤、肺囊性纖維化患者以及溺水者，主要累及皮膚、眼、肺及腦；也可播散全身［1?3］。播散性賽多孢霉感染在多個國家均有報道，包括澳大利亞、美國、加拿大、德國、法國和荷蘭。來自西班牙尤其北部地區(qū)的報告更多。

近年來，分子分類學(xué)研究顯示既往波氏假阿利什霉復(fù)合種表現(xiàn)的真菌更傾向于是一個復(fù)合種［4］，這個復(fù)合種包含5個分支：其中前4個分支只有1個種，分別為Scedosporium aurantiacum、Pseudalle?scheriaminutispora、S．dehoogi、尖端賽多孢（S．a(chǎn)pio?spermum）；第5個進(jìn)化支有4個種，包括波氏假阿利什霉（P．boydii），P．ellipsoidea、P．a(chǎn)ngusta和P．fu?soidea。其中S．a(chǎn)piospermum這個分支和第五個分支在分子上親緣關(guān)系較近，形態(tài)學(xué)上也相似。S．a(chǎn)urantiacum、P．minutispora、S．dehoogi與其他種在形態(tài)學(xué)上容易區(qū)分。賽多孢屬還包括多育賽多孢（S．prolificans），但在親緣關(guān)系上與其他種相距較遠(yuǎn)。本研究利用已經(jīng)過本中心分子鑒定的23株臨床分離株［5］，在此基礎(chǔ)上對賽多孢霉復(fù)合種的不同種進(jìn)行4種抗真菌藥物的體外藥敏研究，比較不同種對抗真菌藥物的敏感性差異。

1　材料與方法

1．1受試菌株

共23株形態(tài)鑒定為波氏假阿利什霉復(fù)合種的臨床分離株，來源于痰、腦積液、肺泡灌洗液和眼分泌物等。其中9株為波氏假阿利什霉，編號分別為BMU00488、BMU01112、BMU01113、BMU01114、BMU01116、BMU01272、BMU02948、BMU07224和BMU07374；6株P(guān)．ellipsoidea，編號分別為BMU01118、BMU04730、BMU04772、BMU04780、BMU05145和BMU07108；1株P(guān)．a(chǎn)ngusta，編號為BMU01115；1株P(guān)．fusoidea，編號為BMU01297；6株尖端賽多孢，編號分別為BMU00491、BMU01117、BMU03882、BMU04111、BMU04729和BMU07462。菌種均保藏于北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心／北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科真菌室?？拐婢幬锩舾行栽囼炈觅|(zhì)控菌株為黃曲霉ATCC204304。

1．2試驗用藥物

伊曲康唑（ITC，中國藥品生物制品檢定所，批號100631?200401，純度99．3%）、伏立康唑（VRC，山東省壽光富康制藥公司，批號070724，純度99．3%）、泊沙康唑（POS，Merck公司，批號171228?49?2，純度＞99%）和兩性霉素B（AMB，美國sigma，批號1397?89?3），用100%分析純度二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）溶解，儲存液的濃度為1 600 μg／mL，藥物儲存液于?30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3菌懸液制備

受試菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，35℃活化7 d。取PDA上的菌落，加入4mL生理鹽水，反復(fù)吹吸混勻后，將菌懸液吸到無菌試管中。以血球計數(shù)板調(diào)整孢子濃度為（1～5）×106mL，再以RPMI 1640液體培養(yǎng)基進(jìn)一步稀釋50倍，即為2倍于最終接種濃度的孢子懸液。

1．4抗真菌藥物體外抑菌活性測定

參照CLSI制定的絲狀真菌藥敏方案M38?A2。采用微量液基稀釋法，分別將VRC、POS、ITC和AMB的藥物儲存液以RPMI 1640液基倍比稀釋，配制成2倍于終濃度的藥液，加入96孔圓底藥敏板。VRC、POS、ITC和AMB的工作濃度均為0．03～16 μg／mL。取100μL藥液分別加入第1～10列各孔，第11列中加入100μL RPMI 1640。第12列設(shè)立陰性對照。向第1～11孔分別加入100μL菌懸液后，35℃孵育48 h、72 h判讀結(jié)果。VRC、POS、ITC和AMB的MIC均定義為與生長對照孔相比生長100%受抑制所對應(yīng)的最低藥物濃度。所有藥敏試驗均重復(fù)操作3遍。

2　結(jié)　果

2．14種抗真菌藥物對23株波氏假性阿利什霉復(fù)合種的體外抑菌作用

4種抗真菌藥物對23株賽多孢霉的藥敏結(jié)果見表1。伏立康唑?qū)λ惺茉嚲昃舾校琈IC范圍為0．25～1 μg／mL，GM值為0．46 μg／mL。泊沙康唑其次，MIC范圍2～4 μg／mL，GM值為2．62 μg／mL。伊曲康唑?qū)?株P(guān)．elliposoidea和2株尖端賽多孢的MIC值為＞16 μg／mL，其余菌株MIC范圍為2～4 μg／mL，對所有菌株的GM值為5．25 μg／mL。兩性霉素B對3株波氏假阿利什霉、2株P(guān)．ellipsoidea、1株P(guān)．fusoidea和1株尖端賽多孢不敏感，MIC值為≥16 μg／mL，其余菌株的MIC值為4 μg／mL、8 μg／mL，對所有菌株的GM值為9．02 μg／mL。

2．25種波氏假性阿利什霉復(fù)合種對抗真菌藥物體外敏感性比較

4種抗真菌藥物對5種菌的藥敏結(jié)果見表2。伏立康唑?qū)Σㄊ霞侔⒗裁?、P．ellipsoidea和尖端賽多孢均敏感；泊沙康唑其次；伊曲康唑?qū)．ellip?soidea、尖端賽多孢的MIC值范圍為2～＞16 μg／mL，菌株間差異較大；對波氏假阿利什霉的MIC值范圍為2～4 μg／mL，菌株間差異較??；兩性霉素B對波氏假阿利什霉、P．ellipsoidea和尖端賽多孢的MIC值范圍均為為4～＞16 μg／mL，GM值差別也不大，分別為8．64μg／mL、8．56μg／mL和8．00μg／ellipsoidea和尖端賽多孢二者均為6株，P．a(chǎn)ngusta、P．fusoidea各1株。

表1　VRC、ITC、POS和AMB對23株病原真菌的最低抑菌濃度（MIC）（μg／mL）Tab．1　The MIC results of 23 pathogenic fungi to VRC，POS，ITC and AMB（μg／mL）

表2　4種抗真菌藥對不同種名的賽多孢霉的MIC值范圍和GM值（μg／mL）Tab．2　The MIC range and GM value of four anti?fungus drugs against different species（μg／mL）

波氏假阿利什霉復(fù)合種的體外藥敏實驗研究mL。本中心中P．a(chǎn)ngusta、P．fusoidea各一株：VRC、POS、ITC和AMB對P．a(chǎn)ngust和P．fusoidea的藥物敏感性與波氏假阿利什霉類似。

3　討　論

波氏假性阿利什霉復(fù)合種是一類致病絲狀真菌，其形態(tài)特征為在沙氏或馬鈴薯培養(yǎng)基上生長迅速，培養(yǎng)7～10 d其菌落表現(xiàn)為白色、絨毛狀，氣生菌絲多，迅速布滿培養(yǎng)皿，日久變?yōu)闊熁疑趁鏋榛液谏?。顯微鏡下菌絲1～3 μm寬，透明分隔，可分支。環(huán)痕產(chǎn)孢，環(huán)痕孢子近球形至橢圓形，無色，基部短縮。分生孢子?？砷L可短，分生孢子單個著生于分生孢子梗頂端，有時可以產(chǎn)生數(shù)個孢子；還有一種產(chǎn)孢方式，為粘束孢的產(chǎn)孢方式。部分菌株培養(yǎng)時可以產(chǎn)生子囊。近來有學(xué)者提出復(fù)合種概念，對表現(xiàn)為波氏假阿利什霉樣的真菌進(jìn)行了細(xì)分，依靠多種分子標(biāo)記區(qū)分出若干種。這些分子標(biāo)記中常用的為β?微管蛋白（BT2或TUB）、鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CAL）和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS），其中BT2和CAL分辨率較高，ITS區(qū)較差［4］。波氏假阿利什霉復(fù)合種中有致病報道的為波氏假阿利什霉、P．ellipsoidea、P．a(chǎn)ngus?ta、P．fusoidea、S．a(chǎn)urantiacum和尖端賽多孢。P．minutispora多為環(huán)境來源，臨床報道只有兩例。波氏假阿利什霉復(fù)合種感染呈地區(qū)性分布，在奧地利、澳大利亞和德國，尖端賽多孢為最常見的種，而在西班牙和法國波氏假阿利什霉為最常見種［6?8］。S．a(chǎn)urantiacum臨床致病報道多來自于澳大利亞。我們對保藏于我中心的23株臨床分離株重新鑒定發(fā)現(xiàn)波氏假阿利什霉最為常見，為9株，其次為P．多較早，但基于最新的分類命名的研究相對較少。國外學(xué)者［9?11］在對波氏假阿利什霉復(fù)合種進(jìn)行分子分類前進(jìn)行的體外藥敏實驗發(fā)現(xiàn)，伏立康唑是最有效的藥物，其最低抑菌濃度的幾何均數(shù)為0．61μg／mL；泊沙康唑為第二位有效藥物，兩性霉素B并不是對所有菌株都有效。

在對菌株重新分類后，我們對波氏假性阿利什霉復(fù)合種的體外藥物敏感性做了新的總結(jié)。對于波氏假阿利什霉，伏立康唑?qū)ζ渥蠲舾?，泊沙康唑和伊曲康唑?qū)ζ涞拿舾行云浯危瑑尚悦顾谺對其的敏感性最差；對于P．ellipsoidea，伏立康唑?qū)ζ涿舾行宰詈?，泊沙康唑其次，伊曲康唑和兩性霉素B對其的敏感性較差；P．a(chǎn)ngusta和P．fusoidea對這4種抗真菌藥物的敏感性與波氏假阿利什霉相似，但由于本研究中，P．a(chǎn)ngusta和P．fusoidea各只有一株，有一定局限性；尖端賽多孢對本研究中的4種抗真菌藥物的敏感性與P．ellipsoidea相似，但伊曲康唑?qū)舛速惗噫弑萈．ellipsoidea敏感。Lackner等［8，12?13］也在重新分類后對尖端賽多孢／波氏假阿利什霉進(jìn)行了體外藥敏實驗，發(fā)現(xiàn)伏立康唑、伊曲康唑、兩性霉素B對P．a(chǎn)piosperma、P．boydii、P．minutispora、P．a(chǎn)ngusta、P．fusoidea和尖端賽多孢的藥物敏感性與種類無明顯相關(guān)性。伏立康唑和泊沙康唑?qū)．a(chǎn)urantiacum較敏感。S．dehoogii幾乎對所有抗真菌藥耐藥，即使伏立康唑?qū)ζ涞腗IC值也大于16 μg／mL。至今全世界S．dehoogii感染的報道只有3例，國內(nèi)未有報道。研究顯示真菌耐藥性在波氏假阿利什霉復(fù)合種中隨機(jī)分布，與種類無明顯相關(guān)關(guān)系。這與本研究結(jié)果類似。某些我國未見或罕見種，比如S．a(chǎn)urantiacum、S．dehoogii和多育賽多孢，它們的抗菌譜與其他種不同［13］。

賽多孢霉屬除了波氏假阿利什霉復(fù)合種外，還包括多育賽多孢。多育賽多孢感染可發(fā)生于免疫缺陷的患者，?？芍旅?，幾乎對所有的抗真菌藥（伏立康唑、泊沙康唑、伊曲康唑、兩性霉素B及卡泊芬凈）都耐藥。多育賽多孢霉我國僅兩例報告，感染率很低［14?15］。

聯(lián)合用藥是對耐藥菌株治療的一種選擇。我們也曾對23株菌中的15株菌進(jìn)行了體外聯(lián)合藥敏實驗的研究，發(fā)現(xiàn)卡泊芬凈與伊曲康唑聯(lián)合時，全部菌株顯示為協(xié)同作用；卡泊芬凈與兩性霉素B聯(lián)合時，有27%的菌株顯示為協(xié)同作用；卡泊芬凈與伏立康唑聯(lián)合時，均表現(xiàn)為無關(guān)作用［16］。Cuenca?Estrella等［17］也發(fā)現(xiàn)唑類藥物和棘白菌素類聯(lián)合對波氏假阿利什霉復(fù)合組有協(xié)同作用，與伏立康唑聯(lián)合時，協(xié)同作用最弱，泊沙康唑其次，伊曲康唑最強(qiáng)。特比萘芬和伏立康唑聯(lián)合對多育賽多孢有協(xié)同作用。

對于本研究的4種抗真菌藥物，伏立康唑最敏感，泊沙康唑其次，伊曲康唑變異較大，兩性霉素B最差。目前就我們結(jié)果來看，所有受試菌株對伏立康唑和泊沙康唑的敏感性差別不大，伊曲康唑在P．ellipsoidea和尖端賽多孢兩種內(nèi)差異較大，鑒別到種是否要成為常規(guī)還依賴于臨床需要。真菌種的差別并不代表著真菌藥物敏感性的的不同，因此在治療前對致病菌株進(jìn)行體外藥敏實驗仍是必需的。

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［本文編輯］王飛

In vitro susceptibility test of clinical isolates of Pseudallescheria boydii complex to four anti?fungus agents

WANG Hong，WAN Zhe，YU Jin
（Department of Dermatology and Venereology，Peking University First Hospital，Research Center for Medical Mycology，Peking Universi?ty，Beijing 100034，China）

ObjectiveTo determine the in vitro susceptibility of Pseudallescheria boydii complex to voriconazole（VRC），posaconazole（POS），itraconazole（ITC）and amphotericin B（AMB）．MethodsThe MICs of VRC，POS，ITC and AMB were deter?mined according to M38?A2 methods in nine isolates of P．boydii，six isolates of P．ellipsoidea，one isolate of P．a(chǎn)ngusta，one isolate of P．fusoidea and six isolates of S．a(chǎn)piospermum．ResultsThe MIC range of VRC and POS were 0．25?1 μg／mL and 2?4 μg／mL．ITC had higher MIC range which was 2?＞16 μg／mL against P．ellipsoidea and S．a(chǎn)piospermum than P．boydii，P．a(chǎn)ngusta，and P．fusoidea（2?4 μg／mL）．The MIC range of AMB against all the species was 4?＞16 μg／mL．ConclusionVRC，POS，ITC and AMB have the similar susceptibility patterns against various types of Pseudallescheria boydii complex．Since ITC was more sensitive to P．boydii，P．a(chǎn)ngusta and P．fusoidea than P．ellipsoidea and S．a(chǎn)piospermum in our study，VRC is the most sensitive drug against all the types and than POS and AMB is the worst one among the four drugs．

Pseudallescheria boydii complex；voriconazole；posaconazole；itraconazole；amphotericin B

R 379．9

A

1673?3827（2015）10?0096?04

王紅，女（漢族），碩士研究生在讀．E?mail：wanghong5018＠126．com

余進(jìn)，E?mail：yujin＠m(xù)edmail．com．cn

2014?10?21