孟云芳　法振宗　方偉　周兆婧　伊九　顧菊林　廖萬清（上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室上海市醫(yī)學真菌研究所上海長征醫(yī)院皮膚科，上海200003）

隱球菌感染體外血腦屏障模型的構(gòu)建與應(yīng)用

孟云芳法振宗方偉周兆婧伊九顧菊林廖萬清
（上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室上海市醫(yī)學真菌研究所上海長征醫(yī)院皮膚科，上海200003）

目的構(gòu)建體外血腦屏障模型，并檢測隱球菌不同菌株穿越血腦屏障的能力。方法本研究應(yīng)用商品化的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系bEND．3構(gòu)建體外血腦屏障模型，并驗證該模型應(yīng)用于隱球菌穿越血腦屏障機制研究的可行性。通過構(gòu)建模型，以非致病性的釀酒酵母作為陰性對照，比較新生隱球菌不同血清型標準株及基因缺陷株穿越體外血腦屏障能力的差異。結(jié)果跨膜電阻值（TEER）檢測提示體外血腦屏障模型構(gòu)建成功。檢測結(jié)果顯示釀酒酵母作為陰性對照穿越血腦屏障效率最低，新生隱球菌血清A型標準株H99穿越細胞屏障效率最強，血清D型標準株JEC21穿越細胞屏障效率顯著低于H99。較之H99，黑色素酶缺陷株lac1△穿越體外血腦屏障模型的效率沒有顯著差異；尿素酶缺陷株ure1△效率顯著下降（P＜0．05），約為標準株H99通過率的59．9%；莢膜缺陷株cap59△突破體外血腦屏障模型效率最低，約為標準株H99的18%（P＜0．001）。結(jié)論隱球菌中樞系統(tǒng)感染體外模型成功構(gòu)建。新生隱球菌突破血腦屏障的能力與其血清型以及莢膜、尿素酶等毒力因子的表達密切相關(guān)。

新生隱球菌；血腦屏障；體外模型；致病機制

［Chin J Mycol，2015，10（2）：92?95］

新生隱球菌是臨床上重要的侵襲性病原真菌，能夠有效突破血腦屏障，繼而感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)致命性腦膜腦炎。闡明隱球菌穿越宿主血腦屏障的機制是預防和治療隱球菌腦膜腦炎的關(guān)鍵?，F(xiàn)有研究認為，隱球菌能夠通過外分泌毒力因子的間接作用或者通過分泌多糖分子與腦微血管內(nèi)皮細胞表面受體直接相互作用，激活內(nèi)皮細胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，進而通過黏附—轉(zhuǎn)胞吞機制穿越血腦屏障［1?3］。探尋新生隱球菌相關(guān)的毒力因子和宿主腦微血管內(nèi)皮細胞的關(guān)鍵信號通路，需要能夠有效模擬“隱球菌—宿主”相互作用并兼顧可操作性的體外血腦屏障模型的支持。本文探究了基于商品化小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系的體外血腦屏障模型在隱球菌嗜中樞感染研究中的可行性。

1　材料與方法

1．1材料與試劑

胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、0．25%胰酶、PBS均購自美國Hyclone公司；谷氨酰胺、非必需氨基酸購自美國Invitrogen公司；0．8 μm PC膜Transwell 24孔板、24孔普通細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Ⅰ型鼠尾膠原購自美國Sigma公司。小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系（bEnd．3）購自美國ATCC；新生隱球菌標準株H99、JEC21以及H99背景的缺陷菌株lac1△、ure1△和cap59△均來源于上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室。Millicell?ERS電阻儀購自德國Millipore公司。

1．2構(gòu)建體外血腦屏障模型

Transwell小室的預處理預鋪鼠尾膠原Tran?well小室的制備。0．1 mol／L醋酸制備2 mg／mL大鼠鼠尾膠原（Collagen）儲存液，于4℃冰箱備用。Transwell小室上室中加入100μL DMEM培養(yǎng)基，于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。0．01 mol／L醋酸溶液稀釋鼠尾膠原儲備液，制備140 μg／μL膠原工作液，吸出小室中培養(yǎng)基并加入上述膠原溶液50μL，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸出多余溶液，于超凈臺中風干，PBS潤洗2次，4℃?zhèn)溆?。不需鋪鼠尾膠原的小室吸出培養(yǎng)基后直接在超凈工作臺中風干。

內(nèi)皮細胞接種和跨膜電阻值（Transendothelial Electrical Resistance，TEER）測定Bend．3細胞系生長至單層后，PBS潤洗2次，加入0．25%胰酶消化、重懸，離心后完全培養(yǎng)基重懸，血細胞計數(shù)板計數(shù)并調(diào)整細胞懸液濃度至2×105／mL。向制備好的Transwell小室中加入100μL上述細胞懸液，下室中加入600μL完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，此時記錄為D0。

培養(yǎng)第3天（D3）開始監(jiān)測內(nèi)皮細胞單層電阻值變化。Millicell?ERS電阻儀電極于70%乙醇溶液中浸泡15min，DMEM培養(yǎng)液中潤洗后備用。檢測方法嚴格參照儀器說明書。直接檢測得到跨膜電阻值Rd，沒有接種細胞的小室跨膜電阻值記錄為Rm，細胞單層跨膜電阻T＝（Rd?Rm）×0．33 cm2（單位：ohm·cm2）。

隱球菌接種和結(jié)果測定菌株分別接種于3mL YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)至飽和狀態(tài)，3 000 r／min，離心3min，PBS清洗，重復2次，完全培養(yǎng)基重懸、計數(shù)。調(diào)整菌懸液濃度至4×105CFU／mL，4℃?zhèn)溆?。實驗當天（D1），小心吸出Transwell上室中培養(yǎng)液，加入上述菌懸液100μL，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

分別于接種隱球菌后3 h、6 h、9 h、24 h取小室下室中液體100μL，涂布YPD平板，立即補充下室中培養(yǎng)液100μL。平板放置30℃孵箱中培養(yǎng)2～3 d后計數(shù)菌落數(shù)，記為通過體外血腦屏障菌落數(shù)估計值C。

1．3建立簡化的隱球菌和腦微血管內(nèi)皮細胞黏附模型（見圖1a）

將生長狀態(tài)良好的Bend．3細胞系消化、重懸，調(diào)整細胞懸液濃度至2×105／mL，向24孔細胞培養(yǎng)板中加入細胞懸液1mL，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約12～16 h至細胞長為致密單層。按照前述方法制備隱球菌懸液，調(diào)整濃度至106CFU／mL。向培養(yǎng)板中加入上述菌懸液1mL，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于接種隱球菌后2 h、4 h，吸出培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，PBS小心清洗孔板4次，洗去未結(jié)合隱球菌，每孔加入500μL Trition X?100，孵育10min，移液器吹打若干次，吸出細胞裂解液，分別轉(zhuǎn)移至滅菌1．5mL離心管中。向孔板中加入500μL PBS，小心吹打后分別轉(zhuǎn)移至上述離心管中。

1．4統(tǒng)計學處理

本文所有數(shù)據(jù)均以t檢驗進行統(tǒng)計分析。所有統(tǒng)計學分析以SPSS軟件（15．0）完成，以P＜0．05作為衡量是否具有統(tǒng)計學差異的標準。

2　結(jié)　果

2．1體外血腦屏障模型的構(gòu)建與檢測

自Transwell上室中接種內(nèi)皮細胞第2天（D1）開始記錄跨內(nèi)皮細胞電阻TEER值的變化，在接種細胞后的4 d內(nèi)TEER值增長明顯，第5天開始該模型的TEER值逐漸穩(wěn)定于85 ohms·cm2（見圖1b）。預包被鼠尾膠原有利于內(nèi)皮細胞單層的形成，但處理組與對照組TEER值沒有明顯差異（P＞0．05）。

2．2不同血清型新生隱球菌穿越血腦屏障效率的評估

利用簡化的體外血腦屏障模型檢測隱球菌血清A型、D型菌株和釀酒酵母通過血腦屏障能力的變化。模型構(gòu)建第5天檢測TEER值，各組之間沒有明顯差異（見圖2a），第6天每孔接種等量隱球菌懸液，于不同時間點收樣檢測下室中通過的隱球菌數(shù)目。與標準株H99相比，血清型D型標準株JEC21、釀酒酵母Y187通過體外血腦屏障能力顯著低于H99（P＜0．05），約為標準株通過率的50%；釀酒酵母突破體外血腦屏障模型的能力最低（見圖2b）。

2．3不同毒力因子缺失對新生隱球菌穿越血腦屏障效率的影響

利用簡化的體外血腦屏障模型，檢測不同毒力因子突變菌株通過血腦屏障效率的變化。模型構(gòu)建第5天檢測TEER值，各組之間沒有明顯差異（見圖3a）。H99，lac1 D，ure1 D，與cap59 D，分別為84．37，83．71，84．04和86．02。第6天每孔接種等量隱球菌懸液，于不同時間點收樣檢測下室中通過的隱球菌數(shù)目。與標準株H99相比，黑色素酶缺陷株lac1△通過體外血腦屏障模型的能力沒有顯著差異；尿素酶缺陷株ure1△通過體外血腦屏障的能力明顯下降（P＜0．001），約為標準株通過率的59．9%；莢膜缺陷株cap59△突破體外血腦屏障模型的能力最低，約為標準株的18%（P＜0．001）（見圖3b）。

3　討　論

新生隱球菌入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)，必須突破宿主血腦屏障的防御。近年來，對于隱球菌穿越血腦屏障機制的研究取得了一定成果［4］，但是由于體外血腦屏障模型的限制，進展相對緩慢。隨著技術(shù)的進步，用于體外研究的血腦屏障模型逐漸多樣化，可操作性也逐漸提高?；诖笫蟆⑴?、豬、小鼠以及人源性原代腦微血管內(nèi)皮細胞的單細胞模型和“內(nèi)皮細胞—星型膠質(zhì)細胞”共培養(yǎng)模型已經(jīng)應(yīng)用于體外藥物中樞通透性、嗜中樞病原菌致病機制等多個研究領(lǐng)域［5］。前期對于隱球菌突破血腦屏障防御的研究主要是在人源性腦微血管內(nèi)皮細胞單細胞培養(yǎng)模型基礎(chǔ)上進行的［1?3］。研究者應(yīng)用患者手術(shù)切除腦組織中正常組織部分，分離純化腦微血管內(nèi)皮細胞接種于Transwell培養(yǎng)板構(gòu)建體外血腦屏障模型。該模型應(yīng)用人源的原代細胞，實驗數(shù)據(jù)最接近體內(nèi)真實情況。然而，其缺陷也是顯而易見的：細胞來源珍貴難于獲得、傳代次數(shù)嚴重受限、原代細胞培養(yǎng)相對困難、模型構(gòu)建周期長、成本高等等，因而嚴重制約了其在實際研究工作中應(yīng)用。

圖1　a．體外血腦屏障示意圖，b．小鼠bEND．3細胞系的體外血腦屏障模型TEER值變化情況　圖2　a．模型構(gòu)建第5天檢測TEER值，各組之間沒有明顯差異；b．不同血清型隱球菌通過血腦屏障的能力差異　圖3　a．模型構(gòu)建第5天檢測TEER值，各組之間沒有明顯差異；b．ure1△與cap59△通過體外血腦屏障模型能力低于標準株H99Fig．1　C．neoformans crosses the bEND．3cell line，an in vitro model of the BBB　Fig．2　Different serotype of C．neoformans cells crosses BBB model　Fig．3　The contribution of laccase，urase and capsule of C．neoformans cells to BBB crossing was examined

為克服上述模型的一系列缺陷，本研究應(yīng)用商品化的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞系bEND．3構(gòu)建了體外血腦屏障模型，并驗證該模型應(yīng)用于隱球菌突破血腦屏障機制相關(guān)研究的可行性。bEND．3細胞系易于獲得，模型構(gòu)建相對簡單省時、節(jié)約實驗成本。根據(jù)以往文獻報道，選用6．6×104／mL濃度內(nèi)皮細胞懸液接種于0．4 μm孔徑、12孔Transwell小室，正常細胞培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，3～4 d即可形成較為完整的細胞單層結(jié)構(gòu)［6］。TEER值是評估細胞屏障模型完整性最準確、最便捷的指標［7］。通過檢測接種后不同時間點模型TEER值，我們發(fā)現(xiàn)該模型TEER值在接種第5天即達到并穩(wěn)定于90 ohms ·cm2，稍低于原代內(nèi)皮細胞模型（～150 ohms· cm2），明顯高于以其他內(nèi)皮細胞系為基礎(chǔ)的血腦屏障模型電阻值（～60 ohms·cm2）［8］。通常，為更好地形成完整單層結(jié)構(gòu)，原代細胞為基礎(chǔ)的血腦屏障模型必須用Ⅰ型膠原預處理Transwell半通透膜。通過比較TEER值，不難發(fā)現(xiàn)膠原預處理對于bEND．3為基礎(chǔ)的血腦屏障模型沒有明顯影響，兩組均能獲得較高的電阻值。因而，該模型的構(gòu)建可以省去膠原純化、處理的繁雜步驟，節(jié)約模型構(gòu)建時間和成本。

通過檢測模型比較新生隱球菌不同血清型標準株：A血清型標準株H99和D血清型標準株JEC21通過bEND．3細胞屏障能力的差異，同時以非致病性的釀酒酵母作為陰性對照，我們發(fā)現(xiàn)，新生隱球菌不同血清型菌株通過該體外血腦屏障的能力不同。A血清菌株對體外血腦屏障的侵襲能力強于D血清型（P＜0．05）。釀酒酵母幾乎不能通過bEND．3構(gòu)建的體外血腦屏障模型，進一步說明該模型能夠較好地模擬體內(nèi)血腦屏障功能。既往研究證實血清型A致病力和毒力高于血清型D型，而血清型A配型α標準株H99致病力最強［9?11］。而我們實驗中發(fā)現(xiàn)血清D型通過血腦屏障模型的能力更弱，這可能是其致病力較血清A型菌株更弱的重要原因之一。

已知隱球菌有多種毒力因子在中樞感染過程中發(fā)揮重要作用，如莢膜、尿素酶、細胞壁多糖（透明質(zhì)酸）等。莢膜是隱球菌最具特征性、最重要的毒力因子，并且可能直接參與隱球菌突破血腦屏障的過程［12］。尿素酶缺陷菌株ure1△中樞感染能力減弱，應(yīng)用尿素酶抑制劑也能有效抑制隱球菌中樞感染，但尚缺少體外實驗證據(jù)支持［13］。利用bEND．3構(gòu)建的體外血腦屏障模型，我們也證實了莢膜、尿素酶在隱球菌突破血腦屏障的過程中發(fā)揮重要作用，而黑色素酶作用有限。莢膜缺陷株cap59△突破體外血腦屏障的能力較背景菌株H99下降了約82%，與其他體外血腦屏障模型得到的結(jié)論一致［1］。尿素酶缺陷株ure1△下降了約40%，與體內(nèi)實驗證據(jù)吻合。

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［本文編輯］衛(wèi)鳳蓮

Construction and application of blood?brain?barrier model in vitro in cryptococcal infection

MENG Yun?fang，F(xiàn)A Zhen?zong，F(xiàn)ANG Wei，ZHOU Zhao?jing，YI Jiu，GU Ju?lin，LIAO Wan?qing
（Shanghai Key Laboratory of Molecular Medical Mycology，Shanghai Institute of Medical Mycology，Department of Dermatology and Venereology，Changzheng Hospital，Shanghai 200003，China）

ObjectiveTo establish an in vitro Blood?Brain?Barrier（BBB）model，which was then applied to evaluate the capaci?ties of different cryptococcal strains in crossing Blood?Brain?Barrier．MethodsMouse brain endothelium cell bEND．3 was used to construct the Blood?Brain?Barrier model in vitro．In order to test its feasibility，we next examined the efficacy of several cryptococcal strains with different serotype or gene mutation in central nervous system（CNS）invasion．ResultsThe transendothelial electrical resistance（TEER）measurement suggested that BBB model was constructed successfully．Compared with C．neoformans serotype A strain H99，JEC21（C．neoformans serotype D）displayed a reduced efficacy in BBB invasion while the negative control strain（non pathogenic Saccharomyces cerevisiae strain Y187）with the lowest efficacy．Furthermore，the ure1△mutant（urease deletion）and the cap59△mutant（capsule deletion）showed a 50%and 80%decrease of their efficacy in crossing BBB compared to their parent strain H99，respectively（P＜0．001）．ConclusionThe in vitro model of cryptococcal CNS infection was established successfully．Se?rotype，urease，and capsule was essential for C．neoformans to cross the Blood?Brain?Barrier．

Cryptococcus neoformans；Blood?Brain?Barrier；in vitro model；pathogenesis

Q 95?33R 379．5

A

1673?3827（2015）10?0092?04

國家973項目（2013CB531601，2013CB531604）；國家自然科學基金（81271799，31170139）；上海市醫(yī)學真菌分子生物學實驗室基金（14DZ2272900）

孟云芳，女（漢族），博士研究生在讀．E?mail：mengyun?fang6．12＠163．com；法振宗，男（漢族），博士研究生在讀．E?mail：fazhenzong＠163．com

廖萬清，E?mail：liaowanqing＠sohu．com；顧菊林，E?mail：wujgjl＠126．com

2015?01?22