徐明　楊利民　王秋泉

摘 要 提出并發(fā)展了一種基于電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）的雙元素標簽標記策略來選擇性識別和檢測硒蛋白/多肽，其中內(nèi)源元素硒（Se）作為硒蛋白/多肽分子的識別元素，外源元素汞（Hg）作為硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子的區(qū)分元素。通過對硒代半胱氨酸（SeCys）和谷胱甘肽過氧化酶1（GPx1）兩種模型分子的研究，外源鄰羧基苯硫甲基汞（CH3Hg-THI）動態(tài)解離的CH3Hg+能夠選擇性標記硒代半胱氨酸殘基（SeCys）中硒醇基（-SeH），但不能標記含硒蛋白/多肽分子的硒代蛋氨酸殘基（SeMet）中的—SeCH3，進而依據(jù)Se和Hg的ICP-MS信號識別和檢測硒蛋白/多肽。本方法應(yīng)用于富硒酵母水溶性提取液的分析，結(jié)果表明，提取液中的硒蛋白/多肽能夠被有效識別和檢測，驗證了Se-Hg雙元素標簽標記策略的發(fā)展是ICP-MS識別和檢測硒蛋白/多肽的一種可行且優(yōu)越的途徑。

關(guān)鍵詞 硒； 汞； 硒蛋白/多肽； 電感耦合等離子體質(zhì)譜

1 引 言

以內(nèi)源元素分析蛋白質(zhì)已有很長的歷史，130年前發(fā)明的凱氏定氮法（Kjeldahl method）就是利用檢測蛋白質(zhì)內(nèi)源元素氮進行蛋白質(zhì)分析的經(jīng)典范例[1]。近二十年來，隨著生命科學(xué)和分析技術(shù)的快速發(fā)展，針對生物分子（如蛋白質(zhì)和多肽）的新元素標簽標記研究策略和方法不斷涌現(xiàn)，而且還在快速發(fā)展進程中[2]。具有優(yōu)異的元素分析能力（高的靈敏度和選擇性）的電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）與元素標簽策略的有機結(jié)合可以實現(xiàn)復(fù)雜生物體系中低豐度蛋白質(zhì)和多肽等生物分子的分析[3～5]。除了內(nèi)源元素標簽，通過人為標記外源元素標簽（如鑭系元素、Hg、Au等）的研究策略因可以進一步擴展研究范圍和彌補內(nèi)源元素標簽的不足，越來越受到重視[6～14]。但是，因為針對目標蛋白質(zhì)/多肽如何建立起內(nèi)源元素標簽和外源標記元素間的關(guān)系還有一定困難，目前報道的研究方法還多集中于單一利用內(nèi)源或外源元素，同時利用兩類元素標簽的研究工作還鮮有報道。內(nèi)源和外源雙元素標記識別策略的建立，需要滿足以下要求：（1）目標生物分子需要含有內(nèi)源性共價結(jié)合的標簽元素；（2）目標生物分子能夠被外源性元素標簽有效標記，并且所標記的外源元素標簽與內(nèi)源標簽元素應(yīng)發(fā)揮各自的識別、區(qū)分和檢測功能；（3）內(nèi)源和外源性元素標簽?zāi)軌蛲瑫r有效地被ICP-MS識別和檢測。

在本課題組以前的研究工作中，不但利用內(nèi)源元素硒（Se）定量地研究了人血漿中的硒蛋白，而且利用外源元素汞（Hg）標簽對多種蛋白和多肽分子實現(xiàn)選擇性的標記和定量分析[14～19]。Se和Hg是一對典型的在生物體中會產(chǎn)生拮抗效應(yīng)的元素，并形成特定的硒汞化合物[20～22]。作為一類重要的生物分子，硒蛋白/多肽中Se以硒醇（—SeH）的形式存在于硒代半胱氨酸殘基中，這為外源的Hg標簽提供了一個理想的標記位點。利用這兩種元素作為內(nèi)源和外源元素標簽識別和檢測硒蛋白/多肽在理論上是可行的。本研究探討了利用外源Hg標簽標記硒蛋白/多肽的可能性，進而實現(xiàn)Se-Hg雙元素標記選擇性識別和檢測硒蛋白/多肽的目的。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

液相色譜-電噴霧質(zhì)譜（Esquire LC/ESI-IT-MS，德國布魯克公司）；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Microflex LRF MALDI-TOF-MS，德國布魯克公司）；SERIES 200液相色譜-ELAN DRC II電感耦合等離子體質(zhì)譜（HPLC-ICP-MS，鉑金埃爾默公司）。為了消除16O2+對32S+的干擾，在測定S時使用O2（99.999%，北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司）將S在動態(tài)反應(yīng)池中氧化為SO（0.6 mL/min O2；RPQ 0.45），檢測32S16O+測定S的含量；監(jiān)測82Se+和202Hg+用于Se和Hg的測定。

硒代胱氨酸（Seleno-DL-cystine， （SeCys）2），硒代蛋氨酸（L-Selenomethionine， SeMet），二硫蘇糖醇（Dithiol dithiothreitol， DTT），鄰羧基苯硫酚（Thiosalicylic acid， HOOCC6H4SH），2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid）和谷胱甘肽過氧化物酶1（Glutathione peroxidase 1， GPx1）均購于美國Sigma-Aldrich 公司；氯化甲基汞（Methylmercuric chloride， CH3HgCl，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）；富硒酵母（Sel-Plex，美國Alltech公司）；用于尺寸排阻色譜的標準物Pyruvate kinase （237.0 kDa）， Bovine serum albumin （66.5 kDa）， Ovalbumin （44.3 kDa）， Lysozyme （14.3 kDa） 和 Cobalamin （1.4 kDa）購自Sigma-Aldrich公司。其它試劑均為分析純以上的純度；高純水（18 MΩ cm，廈門大學(xué)薩本棟微機電中心）。

2.2 實驗方法

2.2.1 CH3Hg-THI標記硒蛋白/多肽 將相同摩爾的氯化甲基汞（CH3HgCl）與鄰羧基苯硫酚（HOOCC6H4SH）混合反應(yīng)，獲得鄰羧基苯硫甲基汞CH3HgS-C6H4COOH（CH3Hg-THI， 4 mmol/L， pH 7.4），并于4℃保存。利用過量的二硫蘇糖醇（DTT）將硒代胱氨酸（10

還原為硒代半胱氨酸（SeCys）。CH3Hg-THI（4 mmol/L， 0.2 mL）標記還原所得的SeCys。在緩沖溶液（20 mmol/L NH4COOCH3， pH 7.4）中37℃孵育1 h后，利用ESI-IT-MS進行分析標記產(chǎn)物。同時，作為對照，硒代蛋氨酸（SeMet）也按照上述過程進行處理分析。

谷胱甘肽過氧化物酶1（GPx1）溶于緩沖液（20 mmol/L NH4COOCH3， pH 7.4）作為儲備液，并保存于

分別與CH3HgCl和CH3Hg-THI（5 μL， 4 mmol/L）進行反應(yīng)（37℃， 1 h）。反應(yīng)結(jié)束后，使用SEC/ICP-MS （尺寸排阻色譜柱，Superdex 75 10/300 GL（GE Healthcare）；流動相： 5 mmol/L Tris + 100 mmol/L NH3HCO3， pH 7.4； 流速： 0.75 mL/min）和RPLC/ESI-MS VP-ODS C18反相色譜柱（日本Shimadzu公司）；流動相A： H2O， 0.05% TFA； 流動相B： Acetonitrile， 0.05% TFA； 流速： 150 μL/min； 洗脫梯度： 0～5 min， 1% B； 5～10 min， 1%～5% B； 10～20 min， 5%～10% B； 20～25 min， 10%～30% B； 25～40 min， 30% B）對標記產(chǎn)物進行分析。每兩次分析間隔，利用1% DTT清洗色譜柱30 min。反應(yīng)產(chǎn)物同時利用MALDI-TOF-MS進行分析。

2.2.2 富硒酵母水溶性提取液的制備和分析 使用5 mL PBS緩沖液（1.4 mmol/L NaCl， 0.27 mmol/L KCl， 1 mmol/L Na2HPO4， 0.18 mmol/L KH2PO4， pH 7.4）于4℃超聲萃取富硒酵母（0.5 g）5 min，于4℃以10000 r/min離心30 min 2次，收集上清液，得到富硒酵母水溶性提取液。于50 μL富硒酵母水溶性提取液樣品中加入CH3Hg-THI（5 μL， 4 mmol/L）進行標記。反應(yīng)產(chǎn)物使用PD minitrap G-10進行脫鹽處理后，利用SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS進行檢測分析。ICP-MS測定（82Se+， 202Hg+和32S16O+）之前，串聯(lián)的UV檢測器（214 nm）對色譜流出物進行檢測。3 結(jié)果與討論

3.1 雙元素標記原理

如圖1a所示，在蛋白質(zhì)/多肽分子中，Se有兩種存在形式：硒代半胱氨酸（SeCys）和硒代蛋氨酸（SeMet），兩者與S的存在形式半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（Met）結(jié)構(gòu)相似。含有SeCys的蛋白/多肽被定義為硒蛋白/多肽，而含有SeMet的蛋白/多肽為含硒的蛋白/多肽，這兩類蛋白/多肽具有不同的生理功能[23]。硒蛋白/多肽的SeCys殘基中的-SeH可以與CH3Hg-THI動態(tài)離解出的CH3Hg+反應(yīng)， 實現(xiàn)選擇性的Hg標記；含有SeMet的含硒蛋白/多肽因Se以-SeCH3的形式存在而不能與Hg反應(yīng)（圖1b）。另一方面，硒醇基-SeH的pKa=5.2低于巰基（-SH）的pKa=8.5大約3個數(shù)量級； 相比于-SH，-SeH活性更高，更易與CH3Hg+反應(yīng)[24，25]。只有被ICP-MS同時檢測到Se和Hg的信號又在ESI-IT-MS上呈現(xiàn)Se和Hg的特征同位素分布的分子才被認為是硒蛋白/多肽；而只檢測到Se或Hg的信號的分子可能是含硒蛋白/多肽或其它含Cys的蛋白/多肽 （圖1c和1d）。這樣就可以實現(xiàn)硒蛋白/多肽的特異性識別。

圖1 內(nèi)源和外源Se-Hg雙元素標記策略識別硒蛋白和多肽

Fig.1 Endogenous and exogenous Se-Hg dual-labeling strategy for recognizing selenoprotein/peptide

3.2 CH3Hg-THI標記硒醇-SeH

為了研究CH3Hg-THI能否選擇性的標記-SeH，首先用DTT還原硒代胱氨酸（SeCys）2得到硒代半胱氨酸SeCys，之后用CH3Hg-THI標記SeCys（圖2a）。實驗結(jié)果表明，通過改變（SeCys）2與DTT的摩爾比，成功地獲得SeCys（m/z 167.6）（圖2b）；其在與CH3Hg-THI反應(yīng)后，SeCys的質(zhì)譜信號消失，同時出現(xiàn)了產(chǎn)物CH3Hg-SeCys的質(zhì)譜信號（m/z 404.6），而且其同位素分布（404.6（23.0%）， 402.6（16.3%）， 403.5（14.9%）， 401.6（12.8%）， 406.6（11.3%）， 400.5（8.4%）， 405.5（6.6%）， 408.5（2.9%）， 399.5（2.1%）， 397.7（0.9%）， 398.6（0.8%））與H2NCOOHCHCH2SeHgCH3的理論同位素分布一致（圖2c），證明SeCys中的-SeH被成功標記。作為對照，SeMet（m/z 197.9和394.8）質(zhì)譜信號在標記反應(yīng)前后并無變化，說明-SeCH3不能被CH3Hg-THI所標記。

圖2 （a）硒代胱氨酸（SeCys）2的DTT還原和CH3Hg-THI標記SeCys反應(yīng)；（b）利用DTT還原硒代胱氨酸（SeCys）2獲得硒代半胱氨酸SeCys的ESI-IT-MS質(zhì)譜圖；（c）CH3Hg-THI標記硒代半胱氨酸SeCys和硒代蛋氨酸SeMet的質(zhì)譜圖

Fig.2 （a） Reduction of （SeCys）2 to SeCys by dithiol dithiothreitol （DTT） and labeling with CH3Hg-THI， （b） ESI-IT-MS of the reduction of （SeCys）2 to SeCys by DTT and （c） labelling of the SeCys and SeMet with CH3Hg+ dynamically released from CH3Hg-THI

3.3 CH3Hg-THI標記硒蛋白GPx1

本實驗選取了一種典型的硒蛋白GPx1作為模型分子，驗證CH3Hg-THI標記GPx1中-SeH反應(yīng)的可行性。GPx1是硒蛋白家族中的一個重要成員，它能夠有效清除生物體中的超氧自由基[26]。GPx1分子由4個Monomer組成，每個Monomer含有1個-SeH基團（SeCys52）和2個-SH基團[27]。作為對照，同時使用CH3Hg+和CH3Hg-THI分別對GPx1進行標記。結(jié)果表明，在生理溶液中直接使用CH3Hg+對GPx1進行標記時出現(xiàn)了白色的蛋白沉淀（圖3a），說明GPx1的分子構(gòu)象被破壞，導(dǎo)致其變性。SEC/ICP-MS的分析結(jié)果也表明溶液中殘存的CH3Hg+標記的GPx1的Se和Hg信號顯著降低（圖3b）。相比于直接使用CH3Hg+，CH3Hg-THI間接地動態(tài)釋放CH3Hg+[17]，并與GPx1反應(yīng)，在標記過程中不會導(dǎo)致GPx1變性（圖3a），這時SEC/ICP-MS可同時檢測到非常強的Se和Hg信號，說明GPx1成功地被CH3Hg-THI標記，并能在生理溶液中穩(wěn)定存在。

利用SEC/ESI-IT-MS和MALDI-TOF-MS對標記后的GPx1進行了分析（如圖3c）。SEC/ESI-IT-MS檢測到的標記前后的M（GPx1 monomer）和標記后產(chǎn)物M（M-（HgCH3）3），分子量分別為22651.5 和23326.9 Da，質(zhì)量差為675.4 Da，說明GPx1 monomer中的-SeH基團和2個-SH基團都被成功標記。MALDI-TOF-MS對相同標記產(chǎn)物的分析結(jié)果表明，除GPx1monomer可以被CH3Hg-THI成功標記外，其二聚體、三聚體和四聚體都可以被成功標記，再次證明CH3Hg-THI動態(tài)標記有利于保持GPx1分子的穩(wěn)定性。進一步利用SEC/ICP-MS對標記反應(yīng)進行了定量分析?；贗CP-MS對202Hg 的檢出限（45 pmol/L），GPx1的檢出限可以達到10 fmol，較通過對82Se的檢測靈敏度（100 fmol）提高1個數(shù)量級，說明外源的Hg標簽除了能夠幫助區(qū)分硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子，也能夠有效提高硒蛋白/多肽的檢測能力，有利于低豐度生物分子的研究。

圖3 （a）CH3Hg+和CH3Hg-THI標記GPx1；（b）SEC-ICP-MS，（c）ESI-IT-MS和（d）MALDI-TOF-MS分析GPx1和其標記產(chǎn)物

Fig.3 （a） Labeling of glucathione peroxidase 1 （GPx1） directly with CH3Hg+ and CH3Hg-THI under the same experimental conditions； （b） Typical chromatograms of SEC-ICP-MS of native and labeled GPx1； Analysis of the native and CH3Hg-tagged GPx1 by （c） ESI-IT-MS and （d） MALDI-TOF-MS

3.4 富硒酵母提取物中硒蛋白/多肽的識別和檢測

富硒酵母中不但含有硒蛋白/多肽，而且有含硒蛋白/多肽和含硒無機小分子，在平衡生物體內(nèi)的Se含量和硒蛋白/多肽功能方面發(fā)揮著重要作用[28～33]。采用PBS緩沖液超聲提取富硒酵母的水溶性組分，對其中硒蛋白/多肽進行識別和檢測。需要注意的是，在CH3Hg-THI標記和SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS檢測之前，并未對富硒酵母的水溶性提取液進行還原，避免因還原反應(yīng)造成二硫鍵斷裂，產(chǎn)生大量SH基團。CH3Hg-THI對富硒酵母水溶性提取液進行標記后，采用兩種色譜模式SEC （圖4a）和RPLC（圖4b）與ICP-MS聯(lián)用進行分析。SEC/ICP-MS結(jié)果表明，在富硒酵母的水溶性提取物主要含有5個含硒餾分（9.6， 12.8， 21.2， 24.6和31.4 min）。因可同時檢測到Se和Hg的信號（圖4a），9.6，12.8和21.2 min這3個餾分中含有硒蛋白/多肽；與分子量標準物的保留時間相比較，9.6 min組分是分子量大于44.3 kDa的硒蛋白，含量占總Se含量的2.6%；12.8 min保留時間與標準GPx1的保留時間一致，富硒酵母水溶性提取樣品中含有GPx1，占總Se的1.1%；21.2 min餾分的分子量介于1.4～14 kDa，是硒多肽，占總Se的58.8 %；而24.6和31.4 min組分的分子量小于1.4 kDa，又因只觀察到Se的信號，它們可能是含硒的小分子化合物，占Se總含量的33.4 %。相比于SEC，RPLC有更高的分辨率。在相同的分離時間（40 min）內(nèi)，RPLC/ICP-MS共檢測到15個色譜峰有Se的信號，其中7個色譜峰

圖4 富硒酵母水溶性提取液的SEC/ICP-MS（a）和RPLC/ICP-MS（b）分析。*標記的色譜峰為潛在的硒蛋白/多肽。（a）中1， 2， 3， 4和5分別表示分子量標志物（237.0， 66.5， 44.3， 14.3 and 1.4 kDa）的保留時間

Fig.4 Typical chromatograms of water-soluble extract of Se-enriched yeast analyzed using （a） SEC-ICP-MS and （b） RP-ICP-MS. The marked （*） peaks indicated possible selenoproteins （peptides） in the extract. 1， 2， 3， 4 and 5 in （a） represent the elution time of the five molecular weight markers used （237.0， 66.5， 44.3， 14.3 and 1.4 kDa）

（*）同時檢測到Se和Hg的信號（圖4b），可認為是硒蛋白/多肽，GPx1位于26.5～30.0 min之間。由圖4b可見，當檢測32S16O+時，高含量組分在10 min前被檢測到，這些都是富硒酵母水溶性提取液中高含量的含Cys的蛋白分子（因硒蛋白分子中也可能含有Cys）；在這樣的高的背景下，本方法仍可以識別硒蛋白/多肽、含硒蛋白/多肽和其他高豐度蛋白/多肽分子，證明了Se-Hg雙元素標簽標記方法在解決識別和檢測硒蛋白/多肽問題上的優(yōu)越性。值得指出的是，更高分辨能力的多維分離技術(shù)和更高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)（如FT-ICR-MS）的聯(lián)合應(yīng)用將有助于已識別的硒蛋白/多肽的組成和結(jié)構(gòu)的進一步鑒定。

4 結(jié) 論

提出并發(fā)展了內(nèi)源和外源雙元素標簽標記策略，此策略使得ICP-MS在識別和檢測硒蛋白/多肽方面展示了前所未有的優(yōu)越性。隨著針對不同重要蛋白/多肽分子的雙元素標簽標記策略研究的深入開展，此策略將在識別和定量已知和未知蛋白/多肽分子方面發(fā)揮重要作用。

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