田慧芳+徐慶春+丁慧榮+田志華+張宏+朱華+王昕+沈靖

摘要 建立了雙功能試劑2-[（4-異硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）與標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)的新方法，測(cè)定了反應(yīng)產(chǎn)物與鑭系金屬Eu的螯合效率，探索了其作為靶向探針和蛋白定量標(biāo)記試劑性能。考察了不同緩沖體系的濃度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量與肽段相對(duì)量、反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相比例，反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)偶聯(lián)效率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： p-SCN-Bn-DOTA量為肽段的32倍，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB （pH 8.5），60℃反應(yīng)60 min， 有機(jī)相與水相之比為4.4∶1（V/V）時(shí)標(biāo)記效率高；在HCl/NaAc緩沖體系（pH 4.0）中60℃反應(yīng)60 min，金屬離子鰲合反應(yīng)效率高達(dá)94%。本研究建立了一種新的基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的標(biāo)記方法，并成功用于RGD肽等的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 雙功能試劑； 標(biāo)記； 多肽； 蛋白定量； 質(zhì)譜

2015-10-03收稿； 2016-03-11接受本文系北京市自然科學(xué)基金（Nos. 7143172， 7143173）資助

E-mail： shenjing69@sina.com

1 引 言

雙功能試劑連接多肽并螯合金屬元素，可以作為靶向探針結(jié)合分子影像技術(shù)用于腫瘤的靶向治療研究[1]，還可以通過標(biāo)記多種金屬元素制備蛋白質(zhì)組學(xué)多重定量試劑[2]，用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、鑒定、分類等研究。因此雙功能試劑在腫瘤研究方面具有良好的應(yīng)用前景。

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，基于靶向多肽RGD進(jìn)行放射性核素標(biāo)記可用于αvβ3（+）腫瘤的無創(chuàng)性檢查以及判斷患者是否適用于抗腫瘤血管形成治療[3～5]。此外，標(biāo)記的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性強(qiáng)、免疫原性低、作用快、易于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，可在基于靶向探針的蛋白的分析檢測(cè)方面發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[6，7]。

在腫瘤蛋白質(zhì)組定量分析研究方面，目前已開發(fā)的方法有基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法，如ICAT[8]、18O酶切標(biāo)記[9]、SILAC[10] 、iTRAQ [11]等，但這些方法普遍存在同位素價(jià)格昂貴、標(biāo)記難度較大、對(duì)質(zhì)譜分析儀器具有選擇性、同位素峰在質(zhì)譜分析時(shí)會(huì)發(fā)生相互干擾等缺點(diǎn)，會(huì)給定量結(jié)果帶來誤差[12]。因此探索非同位素標(biāo)記的方法，開發(fā)具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的蛋白定量試劑具有重要意義。文獻(xiàn)[13～15]報(bào)道了針對(duì)肽段半胱氨酸標(biāo)記設(shè)計(jì)的金屬編碼親和標(biāo)簽。徐明等[16]利用外源Hg標(biāo)簽標(biāo)記硒蛋白/多肽，實(shí)現(xiàn)Se-Hg雙元素標(biāo)記選擇性識(shí)別和檢測(cè)硒蛋白/多肽。但是在實(shí)際的蛋白質(zhì)組學(xué)樣本分析中，需要使用適用于所有肽段的標(biāo)記方法。Liu等[17]開發(fā)了基于雙功能試劑二乙酸胺五乙酸的標(biāo)記方法，實(shí)現(xiàn)了肽段的無歧視標(biāo)記，但所選擇的雙功能試劑標(biāo)記效率不高。針對(duì)此問題，Wang等[18]用羥基琥珀酰亞胺-四氮雜環(huán)十二烷四乙酸（DOTA-NHS-ester） 作為螯合試劑進(jìn)行了初步研究，在此基礎(chǔ)上，文獻(xiàn)[12，19]對(duì)標(biāo)記方法進(jìn)行了優(yōu)化，提高了金屬標(biāo)記效率。

雖然非同位素標(biāo)記的方法已取得了進(jìn)展，但是仍有以下幾方面需要改進(jìn)。首先，DOTA-NHS-ester 容易水解，在反應(yīng)體系中，活化酯與NH2的標(biāo)記反應(yīng)和水解反應(yīng)互相競(jìng)爭(zhēng)，不利于反應(yīng)體系中水相和有機(jī)相組成的確立。其次，肽段中NH2與DOTA-NHS-ester是親核取代反應(yīng)，反應(yīng)體系應(yīng)在中性或偏堿性條件進(jìn)行；而DOTA-NHS-ester 在堿性條件下極易水解，水解產(chǎn)生酸，在一定程度上改變反應(yīng)體系的pH值[20]。因此，DOTA-NHS-ester的水解敏感性高不利于確立標(biāo)記反應(yīng)條件，對(duì)實(shí)際樣本分析條件的限制很大，因此優(yōu)化雙功能試劑的意義重大。

2-[（4-異硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮雜環(huán)十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）是一種被廣泛應(yīng)用的雙功能螯合試劑，如與牛血清白蛋白（BSA）和雞蛋清溶菌酶標(biāo)記可用于腫瘤的檢測(cè)[21]，與利妥昔單抗[22]或核糖核酸[23]反應(yīng)標(biāo)記可以用于抗腫瘤藥的生物分布和顯影的研究，還可以與聚乙二醇[24]標(biāo)記得到膠束用于制劑研發(fā)等。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)較DOTA-NHS-ester穩(wěn)定，不易發(fā)生水解反應(yīng)，這對(duì)于標(biāo)記反應(yīng)條件的確立十分有利，并可以通過螯合金屬離子標(biāo)記氨基多肽?；趐-SCN-Bn-DOTA的標(biāo)記方法的建立不僅有望開發(fā)一種新型的金屬標(biāo)記試劑，用于腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)的多重定量分析，而且可將該試劑用于RGD肽的標(biāo)記，從而有利于腫瘤受體顯像劑的開發(fā)。本研究建立了基于雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA的螯合金屬元素標(biāo)記多肽新技術(shù)，并成功標(biāo)記RGD等標(biāo)準(zhǔn)肽段。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Ultraflex II基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS，德國布魯克公司）；Discovery DV215CD分析天平（美國OHAUS公司）；HQ-60渦旋混勻器（北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；PMC-060掌上離心機(jī)（日本TOMY公司）。

α-氰基-4-羥基肉桂酸（德國布魯克公司）；標(biāo)準(zhǔn)合成肽段 LGEYGFQNALIVR由吉爾生化（上海）有限公司合成；RGD肽由北京中?？滇t(yī)藥科技發(fā)展有限公司合成；三乙二胺碳酸鹽（TEAB）、氯化銪（EuCl3）（美國Sigma-Aldrich公司）；p-SCN-Bn-DOTA（美國 Macrocyclics 公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q（美國Millipore公司）超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段的偶聯(lián)反應(yīng) 100 μL 0.5 μmoL p-SCN-Bn-DOTA溶于二甲基甲酰胺（DMF）， 50 μL 0.68 μmoL肽段LGEYGFQNALIVR溶于TEAB。將兩種溶液以不同比例混合進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，考察TEAB的濃度和pH值、DOTA與肽段的摩爾比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件對(duì)偶聯(lián)效率的影響。其中肽段的終濃度始終為0.05 nmol/μL。稱取RGD肽 1 mg， 加DMF 124 μL，供p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯(lián)反應(yīng)。

2.2.2 偶聯(lián)產(chǎn)物與金屬離子的螯合反應(yīng)

向2.2.1中的反應(yīng)體系加入5 μL 0.1 mol/L EuCl3溶液（鹽酸-乙酸鈉緩沖液或乙酸-乙酸銨緩沖液），再分別加入相應(yīng)的不同pH值的緩沖液50 μL，考察pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)螯合效率的影響。

2.2.3 MALDI-TOF-MS分析 （1）干點(diǎn)法點(diǎn)樣 取1 μL分析樣品點(diǎn)于Ground steel靶板上，自然干燥后，再點(diǎn)5 mg/mL CHCA基質(zhì)溶液（0.1%TFA-50%乙腈溶液）1 μL，自然干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。（2）薄層法點(diǎn)樣 先在靶板上點(diǎn)0.5 μL CHCA基質(zhì)的乙醇過飽和溶液，自然干燥后，再點(diǎn)1 μL CHCA基質(zhì)溶液（5 mg/mL，0.1% TFA-50% 乙腈溶液）和樣品的混合溶液。采用Peptide Calib standard mono 作為標(biāo)準(zhǔn)品校正，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤5 ppm。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集采用反射模式。儀器控制軟件為FlexControl software verion 3.0，數(shù)據(jù)處理軟件為FlexAnalysis software verion 3.0。

3 結(jié)果與討論

3.1 雙功能試劑的選擇

目前針對(duì)巰基的金屬元素標(biāo)記方法較多，標(biāo)記氨基的金屬元素標(biāo)記方法研究較少，已有的標(biāo)記N-端氨基的方法有轉(zhuǎn)氨法等，如先將蛋白的游離N-端氨基轉(zhuǎn)化為活性的羰基，然后與連有肼的熒光基團(tuán)反應(yīng)得到標(biāo)記分子[25] 。氨基的金屬標(biāo)記，理論上可以標(biāo)記所有的肽段，對(duì)所有的肽段和蛋白質(zhì)（含巰基和不含巰基的）都能進(jìn)行定量研究[2，20，26，27]。p-SCN-Bn-DOTA是一種雙功能螯合試劑，可與肽段的氨基共價(jià)結(jié)合，并通過絡(luò)合反應(yīng)螯合金屬離子，與Wang等[18]采用的DOTA-NHS-ester相比，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易水解，既能夠明確反應(yīng)體系中水相和有機(jī)相的比例，又有利于確定反應(yīng)體系的pH值，這些均利于標(biāo)記反應(yīng)條件的確立。

3.2 金屬元素和標(biāo)準(zhǔn)肽段的選擇

p-SCN-Bn-DOTA可與多種稀土金屬離子形成螯合物，其中與鑭系金屬離子形成的螯合物穩(wěn)定性最佳[28]，故選鑭系金屬離子Eu作為螯合標(biāo)簽。

標(biāo)準(zhǔn)肽段的選擇應(yīng)具有典型性，由于實(shí)際的生物樣本大多是通過胰酶酶解成肽段，肽段C端是精氨酸（R）或者賴氨酸（K），故選用常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白牛血清白蛋白的胰酶酶解肽段LGEYGFQNALIVR作為標(biāo)準(zhǔn)肽段之一；RGD肽由于在腫瘤診斷和治療中的重要意義而被選作為標(biāo)準(zhǔn)肽段。

3.3 肽段的金屬元素標(biāo)記反應(yīng)原理

肽段的金屬元素標(biāo)記反應(yīng)的原理如圖1所示，首先是肽段的氨基與p-SCN-Bn-DOTA發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物再與鑭系金屬元素形成穩(wěn)定螯合物。

以產(chǎn)物和反應(yīng)物的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜峰峰面積計(jì)算標(biāo)記反應(yīng)的效率，標(biāo)記效率（%）= 產(chǎn)物峰面積/（產(chǎn)物峰面積+原肽峰面積）×100%。

3.4 p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段偶聯(lián)反應(yīng)的優(yōu)化

3.4.1 緩沖體系對(duì)p-SCN-Bn-DOTA標(biāo)記反應(yīng)的影響 考察了3種緩沖體系NaHCO3-Na2CO3體系、DMF-三乙胺體系以及三乙二胺TEAB體系。對(duì)于0.5 mol/L NaHCO3-Na2CO3緩沖液（pH 8.8），由于反應(yīng)產(chǎn)物鹽濃度過高，需要稀釋50倍以上才能被MALDI-TOF檢測(cè)到，而且鈉鹽是不可揮發(fā)性鹽，Na+對(duì)質(zhì)譜可能產(chǎn)生的干擾不易去除。Scheinberg等[29]將p-SCN-Bn-DOTA與肽段GGGFC在無水的DMF -三乙胺體系中反應(yīng)，但是實(shí)際的生物樣品酶解產(chǎn)物是含水的體系，因此純有機(jī)溶劑的DMF-三乙胺體系不適用于生物樣品酶解產(chǎn)物分析。而TEAB是可揮發(fā)性碳酸鹽，p-SCN-Bn-DOTA與肽段LGEYGFQNALIVR（m/z 1479）可以在TEAB緩沖體系中反應(yīng)生成標(biāo)記產(chǎn)物（m/z 2031），而且結(jié)晶狀態(tài)好，適合質(zhì)譜檢測(cè)，因此， 選擇TEAB體系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化。

3.4.2 p-SCN-Bn-DOTA的量與肽段量的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)標(biāo)記反應(yīng)的影響 由于標(biāo)記反應(yīng)中影響標(biāo)記效率的因素眾多[30，31]，本研究考察了p-SCN-Bn-DOTA量與肽段量的比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等因素，結(jié)果如表1所示。由表1可見，p-SCN-Bn-DOTA和肽段的摩爾比為32倍，在60℃反應(yīng)60 min時(shí)，標(biāo)記效率最高，因此選擇上述條件為最佳反應(yīng)條件。與文獻(xiàn)[20]報(bào)道的DOTA-NHS-ester 50倍過量于肽段、肽段的終濃度為0.125 nmol/μL相比，本方法反應(yīng)試劑的用量少，而且適用的肽段的濃度更低，顯示出更高的標(biāo)記靈敏度。肽段和標(biāo)記產(chǎn)物的質(zhì)譜圖如圖2所示。

3.4.3 反應(yīng)體系中有機(jī)相與水相比例的考察 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化過程中，為保證肽段的終濃度一致，需要改變有機(jī)相和水相的比例來實(shí)現(xiàn)其它參數(shù)的調(diào)整。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，反應(yīng)體系中水的比例越高，標(biāo)記效率越低， 最佳有機(jī)相與水相之比為4∶1～5∶1（V/V）。

3.4.4 緩沖體系濃度及pH值對(duì)反應(yīng)的影響 緩沖體系濃度及pH值是影響螯合劑配位能力的主要因素。本研究考察了0.1， 0.2和0.5 mol/L TEAB緩沖溶液在pH值分別為6.5，7.5，8.5，9.5 時(shí)DOTA與肽段的偶聯(lián)效率，用三乙胺和冰醋酸調(diào)節(jié)pH值。結(jié)果表明，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB， pH 8.5的條件下偶聯(lián)效率較高，且重現(xiàn)性好。

3.5 p-SCN-Bn-DOTA與RGD肽的偶聯(lián)反應(yīng)

按照2.2.1節(jié)實(shí)驗(yàn)方法制備RGD肽，在優(yōu)化的條件下，即緩沖體系為0.2 mol/L TEAB（pH 8.5），與p-SCN-Bn-DOTA在60℃進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)60 min， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，標(biāo)記效率為90.6%。

3.6 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及pH值對(duì)螯合反應(yīng)的影響

對(duì)于EuCl3與DOTA 偶聯(lián)產(chǎn)物的標(biāo)記反應(yīng)，分別考察了乙酸銨-乙酸（HAc-NH4Ac），鹽酸-乙酸鈉（HCl-NaAC）反應(yīng)體系；反應(yīng)溫度為30℃，60℃和100℃；反應(yīng)時(shí)間為15和60 min；pH值為4.0和5.5時(shí)的標(biāo)記效率。結(jié)果如表3及圖4所示， 其中在pH 4.0 的HCl-NaAC緩沖液中，60℃反應(yīng)60 min標(biāo)記效率最高，而且酸性條件下（pH 4.0），可以減少金屬離子和肽段的非特異性結(jié)合。

3.7 MALDI檢測(cè)方法的考察

對(duì)用于MALDI檢測(cè)的樣品點(diǎn)樣方法進(jìn)行了考察，比較了干點(diǎn)法和薄層法兩種方法。如圖5所示，結(jié)果顯示干點(diǎn)法相對(duì)較好，結(jié)晶狀態(tài)均勻，樣品檢測(cè)靈敏度高。

4 結(jié) 論

本研究通過雙功能試劑p-SCN-Bn-DOTA與RGD等標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)，考察與鑭系金屬元素Eu 螯合效率，對(duì)螯合稀土金屬標(biāo)記肽段的反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。p-SCN-Bn-DOTA與標(biāo)準(zhǔn)肽段反應(yīng)的條件為：DOTA 為肽段的32倍，緩沖體系為0.2 mol/L TEAB，pH 8.5，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min； 偶聯(lián)產(chǎn)物與金屬離子反應(yīng)的條件為：pH 4.0的HCl/NaAC緩沖體系中反應(yīng)60 min。MALDI-TOF檢測(cè)時(shí)樣品點(diǎn)樣方法使用干點(diǎn)法較好。本研究結(jié)果表明， p-SCN-Bn-DOTA在標(biāo)記RGD等多肽上有良好的應(yīng)用，有望成為一種新的高靈敏度金屬標(biāo)記試劑和腫瘤受體顯像劑。

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Abstract A novel labeling approach with good compatibility based on 2-（4-isothiocyanatobenzyl）-1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1，4，7，10-tetraacetic acid （p-SCN-Bn-DOTA） was established. The labeling conditions of p-SCN-Bn-DOTA with standard peptides were optimized， and the labeling efficiency of macrocyclic complex of p-SCN-Bn-DOTA with lanthanide metal ion Eu was also investigated. The labeling process was a two-step reaction. The labeling efficiency was affected by several factors including pH， buffer， reaction time， reaction temperature， and ratio of p-SCN-Bn-DOTA to peptide. The optimized conditions were as followed： the first step of labeling reaction was reacted in 0.2 mol/L triethylene diamine （TEAB） （pH 8.5） buffer for 60 min at 60℃， and the molar ratio of p-SCN-Bn-DOTA with peptide was 32. The second step of rare earth metal chelating was in pH 4.0 HCl/NaAC buffer for 60 min at 60℃. This approach was successfully applied in RGD peptide labeling.

Keywords Bifunctional chelating reagents； Labeling； Peptide； Protein quantification； Mass spectrometry