張紅波++高艷平++周恩旭 趙亞影 付莉 高慧茹++任元靜 朱小菲 秦少通

摘要：用胃蛋白酶對(duì)鯉魚魚肉進(jìn)行水解，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取酶濃度、pH值、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間作為影響蛋白提取率的因素。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用4因素3水平響應(yīng)面分析法對(duì)鯉魚多肽的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，確定胃蛋白酶提取鯉魚多肽時(shí)的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，胃蛋白酶酶解的最佳條件為酶質(zhì)量濃度17.77 mg/mL、溫度36.65 ℃、時(shí)間3.7 h、pH值1.07，在該條件下多肽提取質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL。

關(guān)鍵詞：鯉魚；胰蛋白酶；多肽；響應(yīng)面法

中圖分類號(hào)： TS254.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0151-04

[HJ1.4mm]

收稿日期：2015-12-17

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：13A180044）。

作者簡(jiǎn)介：張紅波（1982—），男，河南遂平人，碩士，講師，主要從事生物工程研究。E-mail：zhanghongbo009@163.com。[HJ]

鯉魚屬魚綱鯉科，是淡水魚類中品種最多、分布最廣、養(yǎng)殖歷史最悠久、產(chǎn)量最高的品種之一。從消費(fèi)品種上看，我國水產(chǎn)品中魚類消費(fèi)占50%以上；在消費(fèi)的魚類產(chǎn)品中，消費(fèi)總量超過200萬t的魚類有草魚、鳙魚、鰱魚、鯽魚、鯉魚，這5類魚占淡水魚消費(fèi)總量的70%以上。鯉魚味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，其魚肉中蛋白質(zhì)含量高，質(zhì)量極佳，易被人體消化吸收。蛋白質(zhì)在人體內(nèi)由蛋白酶水解成小肽進(jìn)行吸收。研究發(fā)現(xiàn)，多肽比氨基酸更易被人體吸收利用，且多肽具有多種生物學(xué)作用。某些多肽能夠清除生物體內(nèi)過量的游離基、自由基等，抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，保護(hù)細(xì)胞及其細(xì)胞器的正常生理結(jié)構(gòu)和功能[1]。有些多肽還具有抗疲勞、耐缺氧、抗腫瘤的生物學(xué)作用[2-6]。此外，有些多肽具有免疫調(diào)節(jié)[7]、抗菌[8]、舒張血管的作用[9]。然而，我國對(duì)魚類的加工技術(shù)還不是特別成熟，水產(chǎn)養(yǎng)殖與相關(guān)食品加工行業(yè)的生產(chǎn)效益并不高，且加工形式比較單調(diào)。本研究根據(jù)鯉魚多肽的性質(zhì)，利用酶解法提取鯉魚多肽，并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面分析法對(duì)酶解法制備鯉魚多肽的工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以期得到合理的提取工藝，提高鯉魚多肽的提取率，為探究鯉魚的附加價(jià)值和工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器

鮮活鯉魚，購自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。胃蛋白酶、Tris-堿，均購自上海百賽生物技術(shù)有限公司；雙縮脲A、B，購自上海振品化工有限公司。其他試劑均為分析純。

主要儀器：B1312511型超純水儀，HWS28型電子恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司），101-1SA型定時(shí)恒溫鼓風(fēng)干燥箱（金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司），F(xiàn)E20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，ME204E型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），EnSpireTM型酶標(biāo)儀（鉑金埃爾默儀器[上海]有限公司），WND型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司）。

1.2多肽的提取與測(cè)定

取新鮮鯉魚，去除鱗片和內(nèi)臟等器官，洗凈。選取魚腹肉，稱質(zhì)量后蒸熟，按1 ∶[KG-*3]3的質(zhì)量比添加調(diào)好pH值的Tris-HCl緩沖液，用絞碎機(jī)絞碎；取0.5 mL魚漿，按1 ∶[KG-*3]2的體積比添加一定濃度的蛋白酶液，在恒溫水浴鍋中進(jìn)行水浴，之后用 100 ℃ 沸水滅酶活處理10 min，以4 000 r/min離心 15 min；取上清，按1 ∶[KG-*3]1的體積比添加10%三氯乙酸（TCA），充分混勻后靜置 10 min，以4 000 r/min離心15 min；取上清，與5% TCA按 1 ∶[KG-*3]9 的體積比充分混合，靜置10 min；取 120 mL 上述溶液，按 3 ∶[KG-*3]2 的體積比與雙縮脲試劑混合（以5% TCA作為空白對(duì)照），靜置10 min，以2 000 r/min離心 10 min；取上清，置于96孔板中，于540 nm測(cè)定吸光度[11]。

1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

配置4 mg/mL的四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（Gly-Gly-Tyr-Arg）溶液，用5% TCA進(jìn)行稀釋，分別稀釋至3.500、3.000、2.500、2.000、1.500、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL。取不同稀釋程度的四肽溶液（包括4 mg/mL）120 mL，按3 ∶[KG-*3]2的體積比添加雙縮脲試劑，靜置10 min使之[LM]充分反應(yīng)；以2 000 r/min離心 10 min，取上清置于96孔板中，于540 nm測(cè)定吸光度，根據(jù)所得D540 nm繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4單因素試驗(yàn)

單因素水平如下：胃蛋白酶質(zhì)量濃度分別為1、2、3、4、5、10、15、20、25 mg/mL，pH值分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、30，溫度分別為30、35、40、45、50、55、60 ℃，時(shí)間分別為2、3、4、5、6、7 h。

1.5酶解制備多肽響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以酶解溫度、時(shí)間、酶質(zhì)量濃度、pH值為自變量，以D540 nm為響應(yīng)值，自變量的高、中、低水平分別用1、0、-1編碼值表示（表1）。

2結(jié)果與分析

2.1胃蛋白酶處理的單因素試驗(yàn)結(jié)果

pH值1.5、反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度40 ℃時(shí)，測(cè)定不同酶質(zhì)量濃度對(duì)多肽提取的影響。圖1-A結(jié)果顯示，當(dāng)酶質(zhì)量濃度小于15 mg/mL時(shí)，D540 nm隨著酶質(zhì)量濃度的增大而增大；當(dāng)酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)，D540 nm達(dá)最大值。選擇 15 mg/mL 作為反應(yīng)的最佳酶質(zhì)量濃度。

pH值1.5、反應(yīng)溫度40 ℃、酶質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)，以酶解時(shí)間為自變量，測(cè)定酶解時(shí)間對(duì)多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)酶解時(shí)間低于4 h時(shí)，D540 nm隨著溫度的升高而提高；當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，D540 nm有最大值（圖1-B）。選擇4 h作為反應(yīng)的最佳酶解時(shí)間。

pH值1.5、反應(yīng)時(shí)間4 h、酶質(zhì)量濃度15 mg/mL時(shí)，以酶解溫度為變量，測(cè)定酶解溫度對(duì)多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)溫度低于40 ℃時(shí)，D540 nm隨著溫度的升高而提高；當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，D540 nm有最大值（圖1-C）。選擇40 ℃作為反應(yīng)的最佳酶解溫度。

酶質(zhì)量濃度15 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間4 h、反應(yīng)溫度40 ℃時(shí)，以pH值為變量，測(cè)定pH值對(duì)多肽提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)pH值小于1.0時(shí)，D540 nm隨著pH值的增大而提高；當(dāng)pH值為1.0時(shí)，D540 nm有最大值（圖1-D）。選擇1.0作為反應(yīng)的最佳pH值。

2.2響應(yīng)面分析胃蛋白酶水解效果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解時(shí)間、酶質(zhì)量濃度、pH值作為4個(gè)因素，以D540 nm為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了27組試驗(yàn)，其中1～24組為分析試驗(yàn)和零點(diǎn)試驗(yàn)，25～27組為中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)組合見表2。

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件對(duì)D540 nm與各水解因[JP2]素進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程：D540 nm=0.085+7.250×[JP3]10-4×A-8.917×10-4×B+3.525×10-3×C+4.958×10-3×[JP]D+2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-[JP2]2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-[JP]4.079×10-3×C2-0.022×D2。

方差分析結(jié)果（表3）顯示，試驗(yàn)中一次項(xiàng)C（酶質(zhì)量濃度）、D（pH值）及時(shí)間、酶質(zhì)量濃度、pH值的二次項(xiàng)影響較為顯著，在試驗(yàn)范圍內(nèi)模型的“P值>F值”<0.000 1，表明該二次多項(xiàng)式回歸方程模型達(dá)到了極顯著水平，具有較高的可靠性；R2=0.946 8，表明試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值高度相關(guān)，即相應(yīng)[JP2]值的變化有94.68%來自所選變量；同時(shí)變異系數(shù)（CV）=[JP]561%，且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.069 7>0.05），表明實(shí)際值與模型預(yù)測(cè)值有較好的擬合度?？梢?，試驗(yàn)所建立的數(shù)學(xué)回歸模型擬合度高，可較好地反映各因素與響應(yīng)值間的真實(shí)關(guān)系，因[CM（25]此采用該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)胃蛋白酶提取鯉魚多肽的提取條件。

各因素對(duì)D540 nm的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，其影響效果由F值可得，4個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小依次為D（pH值）>C（酶質(zhì)量濃度）>B（時(shí)間）>A（溫度）。

利用二次多項(xiàng)式回歸方程和Design-Expert 8.0.6.1[JP2]軟件作圖分析（圖2）。所得回歸方程為D540 nm=0.085+7.250×[JP]10-4×A-8.917×10-4×B+3.525×10-3×C+4.958×10-3×D+2.425×10-3×A×B-2.250×10-3×A×C-3350×10-3×A×D-1.700×10-3×B×C-2.750×10-3×B×D-2.325×10-3×C×D-2.454×10-3×A2-4.979×10-3×B2-4.079×10-3×C2-0.022×D2。

對(duì)上述回歸方程求解，可得A=36.65、B=3.70、C=1777、D=1.07，D540 nm有最大值0.086 1。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到當(dāng)前體系下多肽的質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL，即胃蛋白酶酶解鯉魚多肽的最佳條件組合為溫度36.65 ℃、時(shí)間 3.7 h、酶質(zhì)量濃度17.77 mg/mL、pH值1.07，此時(shí)D540 nm為 0.086 1。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，于溫度36.7 ℃、時(shí)間37 h、加酶量17.74 mg/mL、pH值1.06條件下進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得D540 nm為0.086 3。實(shí)測(cè)值與理論值的誤差在±1%左右，可見此模型能較好地預(yù)測(cè)酶水解的最佳條件，預(yù)測(cè)條件可作為最佳水解條件。

[BT1-*5]3結(jié)論與討論

3.1酶質(zhì)量濃度對(duì)酶解結(jié)果的影響

當(dāng)酶用量過少時(shí)，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度，反應(yīng)系統(tǒng)中酶促反應(yīng)速度與酶濃度成正比，隨著酶用量的增大，酶解液中蛋白質(zhì)、多肽與酶作用的機(jī)會(huì)大大增加，分解為游離氨基酸[10]。酶分子過量時(shí)，很多酶分子根本不能發(fā)揮作用，水解度相對(duì)降低，造成不必要的浪費(fèi)。本試驗(yàn)中，當(dāng)酶質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)反應(yīng)效果最佳。響應(yīng)面分析表明，酶質(zhì)量濃度對(duì)胃蛋白酶的提取效果影響較大。

3.2pH值對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響

酶分子是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，具有若干個(gè)活性部位，酶的活性部位由結(jié)合位點(diǎn)和催化位點(diǎn)組成。結(jié)合部位和催化部位對(duì)反應(yīng)體系的pH值變化比較敏感，其解離狀態(tài)隨pH值的變化而變化，這些變化影響了酶分子的特殊構(gòu)象。pH值的變化直接影響了酶與底物的結(jié)合和催化，是酶催化反應(yīng)的主要因素之一[11]。胃蛋白酶的最適pH值范圍約為1.0～2.0，試驗(yàn)測(cè)得最佳pH值為1.06，符合胃蛋白酶的反應(yīng)要求。響應(yīng)面綜合分析各因素表明，pH值對(duì)胃蛋白酶的影響較大。

3.3反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響

溫度對(duì)酶活力的影響較大[12-13]。溫度較低時(shí)，酶活力受到抑制；隨著溫度的升高，加速水解反應(yīng)處于主導(dǎo)地位，達(dá)到最適溫度后，酶失活處于主導(dǎo)地位，酶活隨溫度的升高而下降[14]。因此，本研究選取反應(yīng)溫度為36.65 ℃。響應(yīng)面分析表明，溫度對(duì)胃蛋白酶的影響較小。

3.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響

隨著酶解時(shí)間的延長，多肽被繼續(xù)水解成氨基酸[15]，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，D540 nm達(dá)到最大值，可作為最佳的提取條件。達(dá)到最適時(shí)間后出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，可能是由于水解過于充分，導(dǎo)致水解產(chǎn)生了單個(gè)氨基酸，在雙縮脲反應(yīng)中無法產(chǎn)生顏色反應(yīng)。

3.5結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到了胃蛋白酶處理的最佳條件為溫度36.65 ℃、時(shí)間3.7 h、酶質(zhì)量濃度 17.77 mg/mL、pH值1.07，此體系下的多肽提取質(zhì)量濃度為1.97 mg/mL。本研究表明，基于響應(yīng)面法分析所得的優(yōu)化胃蛋白酶酶解提取鯉魚多肽的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

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