宋毓飛 張 謝 孫蓓蕾 張學(xué)松 黃詩良 黃志剛

寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院消化內(nèi)科(315040)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年因胃癌死亡的患者約73.8萬例，總體5年生存率僅約20%，是一種嚴重威脅人群身體健康的疾?。?-2］。目前胃癌的診斷金標準仍為內(nèi)鏡下取活檢的病理結(jié)果，尚缺乏理想的非侵入性檢查手段。早期胃癌無特異性癥狀，導(dǎo)致許多患者未能及時就診治療，漏診率高。尋找并開發(fā)痛苦小且準確性高的篩查方法(如血液檢查)對提高胃癌早期診斷率和5年生存率非常重要。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中主要的基因?qū)W改變，且此改變發(fā)生在胃癌早期階段［3-4］。本研究通過應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)法檢測胃癌患者和對照者血漿中腫瘤凋亡相關(guān)因子SFRP2［5］和RNF180［6］基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，旨在評估這兩種基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期為胃癌早期診斷以及篩查提供新的非侵入性方法，從而改善胃癌的5年生存率。

材料與方法

一、臨床資料

收集2011年6月-2013年6月浙江省寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院胃小腸外科67例胃癌患者的血漿標本，其中男42例，女25例，年齡31～89歲，中位年齡62歲。納入條件:①患者術(shù)前均經(jīng)胃鏡活檢確診為胃癌，術(shù)后經(jīng)病理切片再次確診;②患者術(shù)前均未接受過任何放、化療;③術(shù)前無其他腫瘤病史。全部病例均按WHO標準和國際抗癌聯(lián)盟TNM系統(tǒng)(2010年)標準進行組織病理分型。另收集同期51名正常健康體檢者的血漿標本作為對照，其中男30名，女21名，年齡30～81歲，中位年齡56歲。本研究方案獲得寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院倫理委員會同意，所有胃癌患者和健康志愿者均簽署知情同意書。

二、研究方法

取受試者周圍靜脈血3 mL，置于EDTA處理過的抗凝管中，3 000×g離心15 min，取上清，標記，置于－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.DNA 提取:每份血漿標本取 400 μL，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)說明書提取DNA，最終以80 μL AE洗脫液洗脫，存于－20℃冰箱備用。

2.DNA 修飾:取 2 μg DNA，按照 EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen)說明書操作。經(jīng)亞硫酸鹽處理后，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，修飾后的DNA用30 μL EB重新溶解，用于MSP檢測。

3.MSP法:設(shè)計 MSP引物序列(表1)。PCR反應(yīng)體系總體積共為50 μL，內(nèi)含2 μL DNA樣品，10 μL 緩沖液(Kapa Biosystems)，1 μL 10 mmol/L dNTP(Kapa Biosystems)，上下游引物(150 mmol/L)各 1 μL，0.5 U Taq 酶(Kapa Biosystems)0.2 μL，超純水34.8 μL。擴增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃30 s，Tm+8℃(Tm 為 DNA解鏈溫度)30 s，72℃1 min，共10個循環(huán);95 ℃ 30 s，Tm ℃ 30 s，72 ℃1 min，共38個循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴增結(jié)束后，產(chǎn)物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳(含溴化乙錠0.5 μg/mL)鑒定，每孔加樣量 10 μL，電泳緩沖液為1×TAE。電泳結(jié)束后，紫外檢測儀下觀察并拍照。

表1 SFRP2［7］、RNF180 MSP 甲基化引物序列

甲基化判定:PCR產(chǎn)物出現(xiàn)甲基化條帶而不出現(xiàn)非甲基化條帶的樣品，判定為基因甲基化;出現(xiàn)非甲基化條帶而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品，判定為基因非甲基化;甲基化條帶和非甲基化條帶均出現(xiàn)的樣品，判定為基因甲基化。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗法。用多因素Logistic回歸法分析2個基因甲基化預(yù)測胃癌的能力。優(yōu)勢比(OR)和95%CI用于分析各基因甲基化間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、血漿SFRP2、RNF180基因甲基化表達

對照組和胃癌患者血漿中SFRP2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為37.3%(19/51)和67.2%(45/67)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);RNF180基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率分別為23.5%(12/51)和53.7%(36/67)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)(圖1)。

圖1 SFRP2、RNF180基因MSP電泳圖

二、SFRP2、RNF180基因異常甲基化與臨床病理特征相關(guān)性

胃癌患者血漿SFRP2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移均無相關(guān)性(P＞0.05)(表2);RNF180基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與性別、年齡無關(guān)(P＞0.05)，但與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P＜0.01)(表2)。

表2 胃癌患者血漿SFRP2、RNF180基因甲基化率與臨床病理特征的相關(guān)性(n)

三、SFRP2、RNF180甲基化預(yù)測胃癌能力以及兩者聯(lián)合診斷胃癌的能力

Logistic回歸顯示，RNF180基因異常甲基化水平(OR=3.0，95%CI:1.3 ～7.0，P ＜0.01)對胃癌的預(yù)測能力稍優(yōu)于SFRP2基因(OR=2.7，95%CI:1.2～6.1，P ＜0.01)。胃癌患者能檢測到 SFRP2 或RNF180基因甲基化水平的敏感性、特異性分別為77.6%和54.9%，而同時檢測到兩種基因甲基化的敏感性和特異性分別為42.7%和88.2%，OR值為5.6(95%CI:2.1 ～14.8)，說明兩種基因聯(lián)合檢測能提高胃癌臨床診斷率，優(yōu)于任一基因的單獨檢測(表3)。

討 論

20余年前，Shapiro等［8］發(fā)現(xiàn)消化道惡性腫瘤患者血清中游離DNA含量明顯高于良性病變患者［(412±63)ng/mL對(118±14)ng/mL］。近年來，通過對這些游離DNA的研究發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳學(xué)改變，如基因甲基化、基因點突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定現(xiàn)象等，其中DNA異常甲基化是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中主要的基因?qū)W改變［4，8］。DNA甲基化能關(guān)閉某些基因活性，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達，DNA甲基化的改變可通過影響癌基因和抑癌基因的表達而參與癌癥的發(fā)生，這為通過檢測血漿DNA甲基化狀態(tài)來篩查早期胃癌提供了可能。

在胃癌患者術(shù)后組織中已發(fā)現(xiàn)許多甲基化狀態(tài)異常的基因。DNA修復(fù)基因hMLH1與胃癌患者術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)，其在胃癌組織中的甲基化率明顯高于遠處正常組織(5.7%對0%)［9］。p16可抑制細胞周期進展，與腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后生存率密切相關(guān)，Wu等［10］發(fā)現(xiàn)胃癌的甲基化率明顯高于癌旁正常組織(85.9%對12.0%)。RUNX3為RUNX轉(zhuǎn)錄家族成員，與腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，Zhang等［11］的研究顯示胃癌組織RUNX3甲基化率為57.6%，甲基化患者中RUNX3表達明顯低于非甲基化患者。DAPK是正向調(diào)節(jié)細胞凋亡因子，與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其在胃癌組織中的甲基化率高于正常組織(12.8% 對 2.7%)［12］。SFRP2 為腫瘤抑制因子，與臨床特征無相關(guān)性，其在胃癌組織中的甲基化率明顯高于正常組織［5，7，13］。RNF180 是最新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑癌因子，目前國內(nèi)外還少有其與臨床特征相關(guān)性的報道，Cheung等［14］發(fā)現(xiàn)胃癌組織中RNF180甲基化率明顯高于正常組織(76%對0%)，但該研究例數(shù)很少，有待進一步證實。

本研究前期對上述6個基因進行了甲基化預(yù)實驗篩查，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測血漿中腫瘤抑制因子SFRP2和RNF180基因甲基化水平對胃癌的臨床診斷價值最高。SFRP2通過基因啟動子區(qū)甲基化使基因沉默，從而激活Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，此信號途徑與包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)［7，15］。本研究結(jié)果顯示胃癌中 SFRP2基因敏感性和特異性分別為67.2%、62.8%，SFRP2甲基化水平與臨床病理特征無相關(guān)性。

環(huán)指蛋白RNF180是膜結(jié)合的E3泛素連接酶，包含RING finger和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，與細胞增殖、分化以及腫瘤形成密切相關(guān)［14，16］。有研究發(fā)現(xiàn)RNF180 mRNA以及蛋白表達在胃癌細胞株、胃癌組織中下調(diào)或消失，且此現(xiàn)象在其他消化道系統(tǒng)癌癥中未發(fā)現(xiàn)，提示RNF180可能是一種新的胃癌特異性腫瘤抑制因子［14］。本研究首次探討了血漿中RNF180甲基化表達水平與胃癌患者臨床資料以及病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示胃癌患者血漿中RNF180甲基化率顯著高于正常健康者，且與腫瘤大小、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移等相關(guān)，提示其與胃癌預(yù)后密切相關(guān);RNF180診斷胃癌的特異性較高，但敏感性較低，與SFRP2聯(lián)合可提高其臨床診斷率，聯(lián)合檢測胃癌血漿SFRP2、RNF180的OR值最高，優(yōu)于任一基因單獨檢測。

表3 SFRP2、RNF180基因甲基化聯(lián)合檢測診斷胃癌的能力

綜上所述，從血漿中尋找基因啟動子區(qū)異常甲基化的特異性腫瘤標志物，對胃癌臨床診斷和預(yù)測有積極的意義。本研究結(jié)果顯示，利用MSP聯(lián)合檢測血漿SFRP2和RNF180基因甲基化，可作為微創(chuàng)檢測方法，有望成為新的輔助胃癌診斷和篩查的分子生物學(xué)指標。本研究所采用的MSP為定量方法，后續(xù)實驗會根據(jù)前期結(jié)果，對SFRP2和RNF180進行焦磷酸測序，進一步驗證聯(lián)合檢測血漿中SFRP2和RNF180基因甲基化水平作為胃癌非侵入性早期篩查的可行性和可信性。

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