靳曙光，張　燚，李泠儀，李　環(huán)

(北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室,吉林 吉林 132013)

鄰苯二甲酸二丁酯對成年大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)及睪酮分泌的影響

靳曙光，張燚，李泠儀，李環(huán)

(北華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室,吉林 吉林 132013)

目的：觀察鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)對成年大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中連接蛋白43(Cx43)的表達(dá)及睪酮分泌的影響，探討DBP對睪酮的調(diào)節(jié)是否與Cx43有關(guān)聯(lián)。方法：將SD大鼠無菌脫臼處死，原代培養(yǎng)純化Leydig細(xì)胞，將細(xì)胞分為溶劑對照組(0.1%DMSO)、DBP組(50 mg·L-1DBP)、Cx43增強(qiáng)劑組(50 mg·L-1DBP+10 μmol·L-1PGE2)和特異睪酮阻斷劑組(40 μmol·L-1氟他胺)，分別處理細(xì)胞24 h；放射免疫法測定Leydig細(xì)胞睪酮水平；細(xì)胞免疫熒光和Western blotting法檢測細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)。結(jié)果：細(xì)胞染毒24 h后，與DMSO組比較，DBP組Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平和睪酮水平均降低(P<0.05)；與DBP組比較，DBP+PGE2組Leydig細(xì)胞中Cx43表達(dá)水平升高(P<0.05)，但睪酮水平變化不明顯(P>0.05)；與DMSO組比較，氟他胺組Leydig細(xì)胞中睪酮水平和Cx43蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論：DBP對睪酮分泌及Cx43表達(dá)均有影響，Cx43對睪酮合成無抑制作用，而睪酮可反向調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)；DBP對Leydig細(xì)胞睪酮合成抑制作用并不一定以Cx43為靶點(diǎn)。

鄰苯二甲酸二丁酯；Leydig細(xì)胞；Cx43；睪酮

鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP)是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物中重要的一類，被廣泛應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。由于DBP并非以化學(xué)鍵的形式綁定在聚合基質(zhì)中，因此在其使用過程中不斷的向外界環(huán)境遷移，造成環(huán)境污染[1]。很多研究[2-3]表明：DBP具有顯著的雄性生殖毒性，可引起雄性嚙齒類動(dòng)物睪丸萎縮和質(zhì)量減輕，睪丸標(biāo)志酶活性降低，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞喪失、曲細(xì)精管變性萎縮及生殖道畸形等。但與其他抗雄性激素不同的是，DBP并不直接作用于雄激素受體，而是通過擾亂睪丸Leydig細(xì)胞中睪酮的生物合成而引起相應(yīng)的生殖毒性，其具體作用機(jī)制尚不十分清楚[4-5]。縫隙連接胞間通訊(gap junction intercellular communication,GJIC)是相鄰細(xì)胞間信息傳遞的一種通訊方式，在睪丸中廣泛存在。研究[6]表明：其對睪丸發(fā)育進(jìn)程的影響以及精子發(fā)生等有重要意義。Cx43是縫隙連接(gap junction ，GJ)在睪丸中最主要表達(dá)的蛋白，其在睪丸中的功能特別是精子形成和緊密連接調(diào)節(jié)的重要作用已有報(bào)道[7-8]，Cx43也是迄今為止在Leydig細(xì)胞中唯一表達(dá)的蛋白[9]，但是其在睪丸Leydig細(xì)胞中的作用尚不清楚。雖然DBP的生殖毒性已有大量報(bào)道，但尚未見其對睪丸Leydig細(xì)胞睪酮合成機(jī)制影響的研究。本實(shí)驗(yàn)以Cx43為檢測靶點(diǎn)，采用Western blotting和免疫熒光法觀察DBP對Leydig細(xì)胞中Cx43的表達(dá)及其分泌睪酮水平的影響。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器清潔級成年雄性健康SD大鼠4只(吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2010-0005。DMEM/F12、胎牛血清購自美國Gbico公司；DBP、膠原酶Ⅰ、PGE2、氟他胺、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記的羊抗小鼠ⅠgG抗體和睪酮測定試劑盒均購自美國Sigma公司；percoll細(xì)胞分離液購自美國Pharmacia公司；4,6-聯(lián)咪-2-萘基-吲哚(DAPI)、小鼠抗大鼠Cx43多克隆抗體及兔抗大鼠β-actin多克隆抗體購自中國Solarbio公司。酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析儀購自美國ABI公司；倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；倒置生物顯微鏡及數(shù)字照相設(shè)備購自日本Nikon公司。

1.2Leydig細(xì)胞分離和鑒定根據(jù)Genissel等[10]的方法并加以改進(jìn)：取成年雄性SD大鼠，無菌取雙側(cè)睪丸，去血管和被膜，D-Hank’s液沖洗后加入0.5%膠原酶Ⅰ，34℃水浴振蕩，加入含有10%胎牛血清終止。靜止3 min取上清，經(jīng)200目細(xì)胞篩過濾，D-Hank’s清洗， 1 000 r·mim-1離心5 min，漂洗2次，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液2 mL。用移液管吸取各密度percoll細(xì)胞分離液2 mL，按密度由高到低貼壁緩慢疊加到10 mL離心管中(梯度自下而上分別是70%、58%、30%和5%)，將待分離的單細(xì)胞懸液添加到最高層。2 000 r·mim-1離心，離心后靜止5 min，在30%和58%percoll濃度之間的條帶即為目標(biāo)細(xì)胞，將條帶用吸管吸出，離心洗滌細(xì)胞2次，計(jì)數(shù)細(xì)胞，使細(xì)胞濃度稀釋為10×105mL-1，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。利用3β-HSD染色法對細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和給藥將Leydig細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(50 mg·L-1DBP)、Cx43增強(qiáng)劑組(50 mg·L-1DBP+10 μmol·L-1PGE2)、特異睪酮阻斷劑組(40 μmol·L-1氟他胺)和溶劑對照組(0.1% DMSO)。

1.4Leydig細(xì)胞睪酮值測定收集不同處理組24 h后的培養(yǎng)液，采用睪酮檢測試劑盒以放射免疫法測定Leydig細(xì)胞中睪酮水平，具體操作流程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5免疫熒光法檢測各組細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)將各組Leydig細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng) 6 h，按照如下操作步驟：細(xì)胞經(jīng)4%的多聚甲醛室溫固定30 min，加入兔抗大鼠Cx43多克隆抗體(1∶100)4 ℃下過夜，加入TRITC標(biāo)記的IgG后室溫孵育1 h，并采用DAPI(100 μg·L-1)染核，室溫下孵育5 min，最后以50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察Cx43在細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.6Western blotting法檢測各組細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后超聲儀充分裂解，收集細(xì)胞蛋白樣品，BCA法測定濃度，以每泳道50 μg蛋白上樣制備好的樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移至NC膜，加入Cx43(1∶100)一抗，4℃過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min。加入山羊抗兔二抗(1∶1 000)，室溫下暗盒孵育1 h，底物顯色，用紅外激光掃描系統(tǒng)成像，采用Quantitiy One軟件對目的條帶灰度進(jìn)行定量分析,Cx43蛋白表達(dá)水平=Cx43蛋白的灰度值/Tublin的灰度值。

2　結(jié)　果

2.1大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)經(jīng)3β-HSD法鑒定，鏡下可見大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈藍(lán)黑色，而其他睪丸細(xì)胞不著色;貼壁24 h后，棄培養(yǎng)液和未貼壁細(xì)胞，獲得較高純度的大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞，純度達(dá)95%以上細(xì)胞融合度達(dá)75%～80%時(shí)，細(xì)胞數(shù)可達(dá)3×106～4.5×106個(gè)(圖1，見插頁四)。

2.2各組Leydig細(xì)胞睪酮水平染毒24 h后，與DMSO組比較，DBP組、DBP+ PGE2組和氟他胺組大鼠Leydig細(xì)胞睪酮水平顯著降低(P<0.05)；但DBP組與DBP+ PGE2組大鼠Leydig細(xì)胞睪酮水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1各組大鼠Leydig細(xì)胞中睪酮水平

GroupTestosteronelevelDMSO16.92±1.85DBP+PGE210.16±1.31*Flutamide2.31±0.27*DBP8.73±1.08*

*P<0.05vsDMSO group.

2.3各組睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示：細(xì)胞染毒培養(yǎng)24 h后，DMSO組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中Cx43廣泛表達(dá)，DBP組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)減弱。DBP+PGE2組加入Cx43增強(qiáng)劑PGE2后，Cx43恢復(fù)表達(dá)，接近DMSO組表達(dá)水平，氟他胺組大鼠睪丸Leydig細(xì)胞中Cx43表達(dá)明顯減弱，見圖2(插頁四)。Western blotting結(jié)果顯示：與DMSO組比較，DBP組Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；DBP+PGE2組Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平高于DBP組(P<0.05)；氟他胺組Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平低于DMSO組(P<0.05)。見圖3和表2。

Lane 1:DBP group;Lane 2:Flutamide group;Lane 3:DBP+PGE2 group;Lane 4:DMSO group.

圖3各組大鼠Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Cx43 protein in Leydig cells of rats in various groups

表2各組大鼠Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)水平

GroupCx43/TublinDMSO8.4805±0.7885DBP+PGE26.8606±0.5865△Flutamide4.9884±0.6553*DBP3.9997±0.4642*

*P<0.05vsDMSO group;△P<0.05vsDBP group.

3　討　論

DBP作為公認(rèn)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物廣泛存在于聚氯乙烯、建筑材料、食品包裝固定液、洗衣粉、潤滑劑和醫(yī)療設(shè)備等中，DBP具有顯著的雄性生殖毒性，可以導(dǎo)致大鼠睪丸萎縮、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞喪失、曲細(xì)精管變性萎縮及生殖道畸形等，而引起此變化與其抗雄性激素作用有關(guān)聯(lián)[2-3]。研究[4-5]表明：DBP并不直接作用于雄激素受體，而是通過擾亂睪丸Leydig細(xì)胞中睪酮的生物合成而引起相應(yīng)的生殖毒性，其具體作用機(jī)制尚不十分清楚。GJIC是通過由連接蛋白構(gòu)成的GJ結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)的一種信息通訊方式，存在于相鄰細(xì)胞間，在維持細(xì)胞間信息的傳遞、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)等過程中均起十分重要的作用[11]。Cx43是GJ在睪丸中最主要表達(dá)的蛋白，Brehm等[13]利用基因敲除技術(shù)，特異性敲除大鼠支持細(xì)胞中的Cx43，結(jié)果在大鼠成年后，睪丸質(zhì)量僅達(dá)到對照組大鼠的50%。免疫組織化學(xué)研究[12-13]結(jié)果顯示：睪丸支持細(xì)胞持續(xù)增殖且出現(xiàn)分化障礙，近腔室內(nèi)已無生殖細(xì)胞但基底室細(xì)胞正常，甚至出現(xiàn)唯支持細(xì)胞綜合征。研究[14]顯示：Cx43與緊密連接蛋白表達(dá)位置基本一致，且在生精上皮周期第Ⅷ期緊密連接更新過程中，Cx43表達(dá)發(fā)生顯著改變。在Leydig細(xì)胞中Cx43是唯一表達(dá)的連接蛋白，研究[15]表明：Leydig細(xì)胞數(shù)量和體積增加的同時(shí)伴隨著Cx43表達(dá)水平升高。本文作者推測DBP可以對Leydig細(xì)胞中Cx43產(chǎn)生影響，且DBP對睪酮的調(diào)節(jié)是以Cx43為靶點(diǎn)起作用。

本研究結(jié)果顯示：Leydig細(xì)胞染毒24 h后，與DMSO組比較，DBP組、DBP+ PGE2組和氟他胺組大鼠Leydig細(xì)胞睪酮水平顯著下降，證實(shí)了DBP可降低睪酮水平的結(jié)論，這與相關(guān)文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致；但DBP組和DBP+ PGE2組大鼠Leydig細(xì)胞睪酮水平無明顯差異，這說明睪酮的生物合成過程與GJIC中Cx43變化無關(guān)聯(lián)。

本研究中細(xì)胞免疫熒光檢測Leydig細(xì)胞中Cx43蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示：Leydig細(xì)胞染毒24 h后，DMSO組細(xì)胞中Cx43廣泛表達(dá)，而DBP組Cx43蛋白的表達(dá)出現(xiàn)明顯抑制，當(dāng)加入PGE2后Cx43表達(dá)水平恢復(fù)接近對照組，而加入氟他胺后Cx43表達(dá)明顯下降。因此，外源化學(xué)物DBP對Cx43功能有明顯抑制作用，同時(shí)睪酮水平的改變與Cx43蛋白表達(dá)水平有關(guān)聯(lián)，且Western blotting結(jié)果也證實(shí)了這一變化規(guī)律，即DBP可顯著抑制Cx43總蛋白表達(dá)；加入PGE2后Cx43蛋白表達(dá)水平顯著提升，氟他胺組Cx43蛋白表達(dá)水平下降。

綜上所述，DBP可引起睪丸Leydig細(xì)胞中睪酮分泌降低，同時(shí)抑制Cx43表達(dá)，但Cx43變化對睪酮合成無抑制作用，而睪酮值變化卻反向調(diào)節(jié)Cx43表達(dá)。本文作者認(rèn)為：DBP對Leydig細(xì)胞睪酮合成抑制作用并不一定以Cx43為靶點(diǎn)調(diào)節(jié)。

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Effects of dibutyl phthalate on expression of Cx43 protein and testosterone excretion in Leydig cells of testicle in adult rats

JIN Shuguang,ZHANG Yi,LI Lingyi,LI Huan

(Department of Environmental Hygiene,Institute of Public Health,Beihua University, Jilin 132013,China)

Objective To explore the effect of dibutyl phthalate(DBP) on the expression of Cx43 protein and testosterone excretion in the Leydig cells of testicle in the adult rats,and to disscuss whether there is relationship between the regulation of testosterone by DBP and Cx43.MethodsAfter the adult SD rats were killed, the cultured primary pure Leydig cells were divided into solvent control group(0.1%DMSO),DBP group (50 mg·L-1DBP),Cx43 enhancer group(50 mg·L-1DBP +10 μmol·L-1PGE2),and specific testosterone blocker group (40 mg·L-1flutamid).After cultured for 24 h，radioimmunoassay was used to measure the levels of testosterone in the Leyding cells; cell immunofluorescence and Western blotting method were performed to detect the expressions of Cx43 protein in the Leydig cells.ResultsCompared with DMSO group,the level of testosterone and the expression level of Cx43 protein in the Leydig cells in DBP group were decreased after 24 h exposure(P<0.05).Compared with DBP group,the testosterone level in DBP+PGE2 group had no obvious change(P>0.05),but the expression level of Cx43 protein was increased(P<0.05).Compared with DMSO group,the level of testosterone and the expression level of Cx43 protein in flutamide group were decreased significantly(P<0.05).ConclusionDBP has the effects on the Cx43 expression and testosterone excreation,and Cx43 has no inhibitory effect on the synthesis of testosterone.However,testosterone can regulate the expression of Cx43 reversely.Therefore,it’s not necessary to take Cx43 as the target of DBP in adjusting the synthesis of testosterone in Leydig cells.

dibutyl phthalate;Leydig cells;Cx43;testosterone

1671-587Ⅹ(2015)02-0295-04

10.13481/j.1671-587x.20150217

2014-09-16

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20100139，201205038)；吉林省教育廳科研項(xiàng)目資助課題(2011129，2014211);北華大學(xué)大學(xué)生國家級創(chuàng)新項(xiàng)目資助課題(201310201050)

靳曙光(1966-)，男，吉林省吉林市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事環(huán)境衛(wèi)生學(xué)方面的研究。

李環(huán)，講師(Tel:0432-64608343,E-mail:jllihuan@126.com)

R961

A