程千松 王興兵 汪 健 虞國慧

230001合肥 安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血液內(nèi)科(王興兵，汪健)

骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)是骨髓造血微環(huán)境中一種重要的多潛能非造血祖細胞，具有支持造血、調(diào)節(jié)干細胞龕位等多種功能。BM-MSC能夠體外誘導(dǎo)定向分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)元細胞等細胞類型［1，2］，參與組織損傷的修復(fù)及再生。研究［3］顯示，BM-MSC 中有多種 Toll樣受體(TLR)的表達，通過TLR激動劑活化BM-MSC能夠調(diào)節(jié)其多種生物學(xué)功能。

目前，有關(guān)TLR活化對MSC的分化影響各家報道不一［4－6］。本文研究了BM-MSC體外誘導(dǎo)的多分化潛能，觀察TLR激動劑對BM-MSC成骨和成脂分化能力的影響，以進一步探討B(tài)M-MSC介導(dǎo)的組織損傷修復(fù)機制，并為提高其療效尋找新的靶點。

1 材料及方法

1.1 TLR激動劑的制備 TLR2激動劑PAM3CSK4、TLR4激動劑LPS購自R＆D公司，予無菌PBS稀釋到所需濃度備用。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng) 取健康志愿者的骨髓5mL(研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得研究對象的知情同意)，給予PBS 1∶1稀釋后，加入淋巴細胞分離液中(密度:1.077g/mL，Solarbio公司)，400g離心20min分離出單個核細胞，給予PBS清洗一遍后棄上清，以含10%FBS(Gibco公司)、100U/L青霉素及100U/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)按1×106/mL的密度轉(zhuǎn)移于25cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng) 48h，后完全換液以去除懸浮細胞，以后每周換液2次。當(dāng)細胞接近100%融合后，用含0.25%胰酶的消化液(Hyclone公司)消化，以1∶2的比例傳代。

1.3 BM-MSC表面TLR2及TLR4的檢測 取第3代BM-MSC，應(yīng)用0.25%的胰蛋白酶消化并收獲細胞，后用PBS充分洗滌及吹打后制成單細胞懸液，分別加入TLR2-FITC及TLR4-PE熒光標(biāo)記的單克隆抗體(eBioscience公司)，在4℃，避光孵育20min后加PBS 1mL進行洗滌，棄去上清液，給予PBS 200mL進行重懸，應(yīng)用振蕩器振蕩混勻后，24h內(nèi)于FACS Caliber四色流式細胞儀檢測，每次獲取的細胞數(shù)為5000～10000，每種標(biāo)記抗體分別加做空白對照及同型對照做為參考。

1.4 成脂誘導(dǎo)分化 將骨髓間充質(zhì)干細胞以2×104/cm2的密度接種于6孔板，當(dāng)細胞達到完全融合后，換成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(內(nèi)含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素、1μmol/L 地塞米松、10μg/mL 胰島素、0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、100μmol/L吲哚美辛的DMEM培養(yǎng)基，廣州賽業(yè)公司)，3d后換成脂肪誘導(dǎo)維持培養(yǎng)基(內(nèi)含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，賽業(yè)公司)。24h后，再將培養(yǎng)基換為脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)/維持3遍后，在脂肪誘導(dǎo)維持培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7d，吸除培養(yǎng)基并給予PBS清洗1次，給予2mL 4%的甲醛固定30min后PBS清洗2次，并且給予1mL油紅O工作液染色30min，給予PBS清洗2～3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，隨機觀察5個不重疊視野，并在低倍鏡下計數(shù)500個細胞，計算成脂率(含有脂質(zhì)空泡的細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%)。

1.5 成骨誘導(dǎo)分化 將骨髓間充質(zhì)干細胞以3×103/cm2的密度接種于明膠(sigma公司)包被的6孔板，24h后換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(內(nèi)含10%FBS、100U/mL青霉素、100U/mL 鏈霉素、0.1μmol/L 地塞米松、50μmol/L 抗壞血酸、10mmol/L β-甘油磷酸鹽的DMEM培養(yǎng)基，廣州賽業(yè)公司)，后每3天給予新鮮成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基完全換液1次。培養(yǎng)3周后，吸除培養(yǎng)基，給予PBS沖洗1次，給予2mL 4%的甲醛固定30min，給予PBS清洗2次，并且給予茜素紅工作液染色3～5min，給予PBS清洗2～3次，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像，隨機觀察5個不重疊視野，并在低倍鏡下計數(shù)500個細胞，計算形成鈣化結(jié)節(jié)形成率(鈣化結(jié)節(jié)染色陽性的細胞/總細胞數(shù)×100%)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料用±s表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)表面TLR2及TLR4的表達 取第3代BM-MSC進行流式細胞分析，研究發(fā)現(xiàn)，BM-MSC表面表達TLR2及TLR4，見圖1。

2.2 人BM-MSC分化能力的鑒定 取第3代細胞進行分化實驗。在成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中，培養(yǎng)3d后即可見部分細胞胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)少量細小脂質(zhì)空泡，后含有脂質(zhì)空泡的細胞數(shù)量逐漸增加，且胞內(nèi)脂質(zhì)空泡數(shù)量增加并相互融合，同時細胞形狀變形，由梭形變成橢圓形。培養(yǎng)2～3周后，胞質(zhì)內(nèi)充滿脂質(zhì)空泡并將胞核擠壓至一側(cè)，油紅O染色后顯示胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)空泡呈紅色，胞核呈淡藍色(圖2)。在成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中，培養(yǎng)3～5d后可出現(xiàn)細胞外基質(zhì)少量顆粒性鈣鹽沉積，細胞形狀改變不明顯，培養(yǎng)2～3周后，細胞外基質(zhì)出現(xiàn)大量泥沙樣鈣鹽沉積，部分融合呈塊狀，茜素紅染色后顯示細胞外基質(zhì)大量紅色鈣鹽沉積(圖3)。

2.3 TLR激動劑對BM-MSC成脂及成骨分化能力的影響 分別在分化培養(yǎng)基中添加PAM3CSK4或LPS，終濃度均為100ng/mL，進行誘導(dǎo)分化實驗。脂肪誘導(dǎo)分化3周后，對照組成脂率為(89.37±8.34)%，PAM3CSK4組為(87.50±6.50)%(P ＞0.05)，LPS 組為(85.45±7.62)%(P ＞0.05)，較空白組無明顯差異(圖4);成骨誘導(dǎo)分化2周后，對照組的鈣化結(jié)節(jié)形成率為(53.50±5.97)%，PAM3CSK4及 LPS組分別為(75.80±10.32)%及(71.43±12.55)%，較對照組明顯增加(t=4.582，P ＜ 0.05;t=3.160，P ＜0.05)，見圖5。

2.4 TLR激動劑預(yù)刺激對BM-MSC成骨分化能力的影響 分別以100ng/mL的PAM3CSK4或100ng/mL的LPS預(yù)刺激BM-MSC 24h后，再將各組細胞進行成脂及成骨誘導(dǎo)分化3周，比較活化組及未活化組BMMSC分化能力改變情況。結(jié)果顯示，活化組較未活化組成脂率及成骨分化能力均無顯著性改變。

3 討論

BM-MSC是骨髓中一種重要的多潛能干細胞，可通過其塑料黏附活性從其它細胞中分離出來，培養(yǎng)后呈成纖維樣細胞。BM-MSC在體外能夠在不同的分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分化成不同的細胞類型［1，2，7］，其另一個特點是低表達HLA-Ⅰ類分子，不表達HLA-Ⅱ類及共刺激分子(CD40、CD80、CD86等)，而這些分子在抗原提呈及免疫反應(yīng)中起重要作用，因此間充質(zhì)干細胞能夠逃避機體免疫系統(tǒng)的免疫監(jiān)視［3］，這些特點使MSC成為細胞治療及再生醫(yī)學(xué)中重要的細胞治療工具。

TLR做為分布于免疫細胞上的一種模式識別受體，能夠識別外源性病原菌、啟動固有免疫反應(yīng)及調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng);TLR還能夠識別各種內(nèi)源性配體，如熱休克蛋白(HSP)，高遷移率族蛋白B1等，參與組織損傷的修復(fù)［8］。多項研究［9，10］還表明，TLR 與胰腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發(fā)病及治療密切相關(guān)。最近研究表明，BM-MSC表達多種TLR，并且在給予TLR激動劑活化后能夠調(diào)節(jié)其多種生物學(xué)功能。我們的研究表明，人BM-MSC表達TLR1-6，并在體外證實TLR2激動劑(PAM3CSK4)和(或)TLR4激動劑(LPS)活化的BMMSC能促進臍血CD34+T細胞的增殖和向髓系分化，且這一作用可能與PAM3CSK4和LPS顯著上調(diào)MSC造血相關(guān)細胞因子的分泌有關(guān)［11］。Liotta等［6］研究顯示，人BM-MSC在給予TLR3、4活化后，能夠抑制其對T細胞的免疫調(diào)節(jié)活力。Tomchuck等［12］研究顯示，TLR可活化人BM-MSC內(nèi)信號產(chǎn)道通路，介導(dǎo)多種細胞因子、趨化因子的產(chǎn)生，并且增強BM-MSC的體外遷移功能。

有關(guān)TLRs活化對MSC的分化影響各家報道不一。Lombardo等［4］發(fā)現(xiàn)，TLR3激動劑(Poly I:C)和TLR4激動劑(LPS)可促進人脂肪來源的MSC(ADMSC)向成骨分化，但對其脂肪分化無影響。Hwa等研究發(fā)現(xiàn)LPS及TLR2激動劑(肽聚糖)能夠促進ADMSC向成骨分化［5］，他們均報道肽聚糖會降低脂肪分化。Mo等［13］報道，在LPS長時間刺激BM-MSC后，會促進其向成骨分化。而Liotta等［6］研究發(fā)現(xiàn)，TLR激活對于BM-MSC的成骨，軟骨及脂肪分化均無明顯影響。眾多研究結(jié)果不一致可能與TLR激動劑刺激時間、激動劑濃度、MSC來源不用等因素有關(guān)。實驗中，我們證實了在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)中，人BM-MSC能夠定向分化為成骨及脂肪細胞，TLR2及TLR4激動劑能促進人BM-MSC向成骨細胞分化，不影響其向脂肪細胞分化。進一步研究顯示，TLR激動劑短暫預(yù)刺激活化細胞并不影響其成骨分化能力，這提示PAM3CSK4及LPS促進人BM-MSC成骨分化需要TLR激動劑的持續(xù)暴露，與TLR短暫的活化無關(guān)。

研究證實，循環(huán)中的間充質(zhì)干細胞能夠遷移到組織損傷部位進行組織修復(fù)功能，同時間充質(zhì)干細胞具有多分化潛能及免疫抑制能力，故已廣泛應(yīng)用于組織損傷、移植物抗宿主病、心肌梗死等疾病治療中［14，15］。在組織損傷過程中，有大量細胞內(nèi)外降解產(chǎn)物的釋放，而這些產(chǎn)物中含有大量TLR的內(nèi)源性配體，這些內(nèi)源性配體通過活化植入體內(nèi)的間充質(zhì)干細胞表面的TLR，可能對其組織損傷修復(fù)功能起到重要調(diào)節(jié)作用。

總之，PAM3CSK4及LPS能夠促進BM-MSC向成骨細胞分化，這種作用需要其持續(xù)暴露于分化培養(yǎng)基中，這對組織工程研究及組織損傷后間充質(zhì)干細胞移植研究具有重要意義。對于TLR受體激動劑對間充質(zhì)干細胞其他分化潛能的影響及其體內(nèi)作用機制值得進一步深入研究。

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