張笛，鄧滿鳳，趙赫，曹宏斌,2，張松平

（1中國科學院過程工程研究所，北京 100190；2天津化學化工協同創(chuàng)新中心，天津 300072）

引 言

隨著中國工業(yè)化的不斷發(fā)展，工業(yè)“三廢”不能得到有效的控制，污水灌溉、污泥施肥等使水體的污染日益加劇，尤其是酚類有機物的污染給人類生活帶來嚴重的影響。4-氯酚（4-CP）屬于氯酚類污染物的一種，它作為重要的工業(yè)原料主要用于除草劑、殺蟲劑、防銹劑、木材防腐劑和染料等物質的合成[1]。4-CP的化學性質比較穩(wěn)定，在自然環(huán)境中能夠長期存在且很難被降解，因此會對生物體造成一定的危害，其生物毒性隨濃度的增加而增大。目前，4-CP去除的方法主要有活性炭吸附法、電化學降解、光催化氧化法和微生物降解法等[2-4]。雖然這些傳統的處理方法起到了一定的作用，但對于微量氯酚類有機物的去除效果卻不太理想。

酶催化技術具有反應條件溫和、反應速度快、催化效率高、對低濃度微量有機污染物選擇性高等特點，因此酶催化技術與傳統方法結合來降解氯酚類污染物也受到越來越多的關注[5-7]。漆酶是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化氧化各種氯酚類物質，是一種綠色環(huán)保的催化劑[8]。相比游離酶而言，固定化漆酶在使用過程中的穩(wěn)定性高，便于回收利用，因此它在酚類廢水處理方面具有廣闊的應用前景。

目前，用于固定化漆酶的載體主要有活性炭[9]、多孔碳[10]、微球[11]、膜[12]等。由于磁性載體固定化酶在磁場作用下可從反應體系中迅速分離，有利于重復利用且降低成本，因此磁性載體固定化酶也越來越受到關注[13]。其中，磁性二氧化硅粒子不僅具有較高的比表面積，可調的孔徑及表面性能，而且其制備過程相對簡便，因此被廣泛用作酶固定化的載體。

多巴胺（dopamine，DA）作為一種新型的聚合物材料被廣泛用于酶的固定化領域[14]。據研究發(fā)現，DA是一種仿生物黏合蛋白，在水溶液中，它能夠在溶解氧的作用下發(fā)生聚合反應，形成強力黏附于固體表面的聚多巴胺（PDA）層，酶蛋白分子在此聚合反應過程中能被牢固地包裹固定在聚合層內[15]。DA的這種黏附行為主要源自其分子結構上的氨基和鄰苯二酚基團，這種結構能夠與無機-有機材料建立起非共價和共價的相互作用，從而使PDA強力黏附于固體材料的表面上[16]。由于多巴胺的生物相容性好，反應條件溫和，聚合過程快，反應可控[17-18]，因此它作為一種較理想的聚合材料在酶的固定化領域具有廣闊的應用前景。然而，通過多巴胺自聚合用于二氧化硅磁性納米顆粒固定化漆酶來降解 4-CP的研究還未見報道。

在以前的研究中[19]，通過多巴胺的自聚合，制備了聚多巴胺-磁性納米二氧化硅材料并用于固定化漆酶，本文主要將制備的多巴胺包埋磁性二氧化硅固定化漆酶用于水體中4-CP的去除實驗，進一步探討其對污染物的催化性能及影響因素，以期為固定化酶催化降解廢水中有機物的實際應用提供 指導。

1 實驗材料和方法

1.1 材料

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2，Sigma公司）； 2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸銨）（ABTS，Sigma公司）；多巴胺（DA，武漢遠成科技公司）。實驗用水為Milli-Q 超純水（Millipore 公司），其余均為國藥集團化學試劑有限公司分析純試劑。

1.2 分析測試儀器

紫外可見分光光度計（UNICO 2800型），上海實驗設備有限公司；電動機械攪拌裝置（JJ-2型），江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；混合振蕩器（XH-C型），江蘇省金云市醫(yī)療儀器廠；恒溫冷凍搖床（SPH-200B型），上海世平有限公司；高效液相色譜（Agilent 1200型），美國Agilent公司；離心機（TGL-16C型），上海安亭科學儀器廠；電子微量天平（BS-124S型），北京賽多利斯儀器系統有限公司；濁度儀（HACH-2100Q型），上海京工實業(yè)有限公司。冷場掃描電子顯微鏡（JSM-6700F型），日本JEOL公司；激光粒度分析儀（Coulter Model N4SD型）, 美國Beckman Coulter公司； X射線衍射儀（PW 3040-60型），荷蘭 Philips 分析儀器公司。

1.3 酶固定化條件優(yōu)化及熱穩(wěn)定性測定

本實驗以溶液pH、漆酶濃度、固定化時間因素，設計一組3因素3水平的正交實驗來優(yōu)化Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的制備，溶液pH分別為5、6、7，漆酶濃度分別為0.25、0.5、0.75 mg·ml-1，固定化時間分別為6、12、18 h。

將游離酶、Fe3O4@SiO2-PDA-Lac分別置于 50℃的恒溫水浴鍋中保存6 h，每隔1 h取樣進行檢測漆酶的活性，其中以第1次測定的活性大小為100%來計算，用來對比考察固定化漆酶對不同溫度的耐受性。酶活性測定方法如文獻[19]。

1.4 模擬水樣的配制

取一定量的4-CP用去離子水溶解配制成質量濃度為10 mg·L-1的反應液，并加入一定量的堿度、離子強度、濁度，使其與天然水體條件相似。具體步驟如下：加入一定量的碳酸氫鈉，使堿度為100 mg·L-1（以 CaCO3計算）；加入一定量的氯化鉀，使離子強度為3.3 mmol·L-1；加入一定量高嶺土，使?jié)岫葹?20 NTU。以上溶液配制完成后均勻攪拌2 h，測定初始溶液的pH，并置于4℃的冰箱中保存待用。

1.5 固定化漆酶去除4-CP

將50 ml上述配制好的4-CP溶液加入到體積為150 ml的反應器，向該反應器中投加一定量的固定化漆酶，在150 r·min-1的機械攪拌下反應10 min后，用磁鐵將反應器中的固定化漆酶分離回收，接著投加PAC絮凝劑（以4 mg Al·L-1計算)，以150 r·min-1快速攪拌2 min，50 r·min-1慢速攪拌15 min，靜置沉降30 min。取1 ml上清液經0.22 μm濾膜過濾后，進高效液相色譜儀（HPLC）中測量4-CP的殘留量。

1.6 4-CP 檢測方法的建立

在磁性納米顆粒固定化漆酶去除4-CP的實驗中，以HPLC作為4-CP的檢測手段，紫外檢測波長279 nm，檢測器柱溫35℃，流動相甲醇和水（體積配比為50:50)，流速0.25 ml·h-1，進樣體積20 μl，檢測時間15 min。

4-CP標準曲線的建立方法具體如下：取一定量的4-CP溶液分別配制成0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mg·L-1的待測液，用HPLC在紫外波長279 nm處檢測4-CP的含量。4-CP的標準工作曲線為：Y=68.08X+13.14（R2=0.9975）。

1.7 固定化漆酶去除4-CP的條件優(yōu)化

（1）溶液pH對4-CP去除率的影響

為了探究不同pH的反應溶液對游離漆酶和固定化漆酶去除4-CP的影響，本實驗將反應體系的pH分別設為2、3、4、5、6、7、8，其中，游離漆酶和固定化漆酶的濃度都是1.2 U·ml-1。在30℃ 條件下，將反應混合物置于150 r·min-1轉速的搖床中振蕩反應8 h，每隔1 h取1 ml反應液并且滴加少量的濃H2SO4終止酶反應，經0.22 μm的濾膜過濾后，用HPLC檢測分析體系中4-CP的殘留量。

（2）漆酶濃度對4-CP去除率的影響

為了考察不同濃度的游離漆酶和固定化漆酶對4-CP降解過程的影響，在幾組反應液中加入一定量的游離漆酶或固定化漆酶，使其終濃度分別為0.4、0.8和1.2 U·ml-1。反應體系在30℃條件下150 r·min-1轉速的搖床中振蕩反應8 h，每間隔1 h取1 ml反應液并且滴加少量的濃H2SO4終止酶反應，經過0.22 μm的濾膜過濾后，用HPLC進行檢測分析反應體系中4-CP的殘留量。

（3）ABTS對4-CP去除率的影響

為了考察ABTS對游離漆酶和固定化漆酶催化降解4-CP的影響，本實驗設計了幾組實驗進行探究。其中，漆酶的濃度分別為1.2，2.4，3.6 U·ml-1，ABTS濃度為50 μmol·L-1，以不加ABTS的反應作為對照實驗。反應液在30℃條件下，150 r·min-1的搖床中反應10 min后，滴加一定量的濃H2SO4終止反應，取出1 ml上清液經0.22 μm的濾膜過濾后，進HPLC中檢測分析體系中4-CP的殘留量。

1.8 固定化漆酶在去除4-CP中的重復使用性

為了研究固定化漆酶在去除4-CP實驗中的重復使用性，先配制20 ml質量濃度為10 mg·ml-1的4-CP反應液，加入一定量的固定化漆酶，使其濃度為1.2 U·ml-1。在30℃條件下150 r·min-1轉速的搖床中反應2 h后，用磁鐵將固定化漆酶從體系中分離出來，取出1 ml上清液經0.22 μm的濾膜過濾后，進HPLC檢測4-CP的殘留量，將分離的固定化漆酶洗滌2次后用于下次重復實驗，如此反復使用10次。

2 實驗結果與討論

2.1 磁性顆粒的表征

2.1.1 磁性納米顆粒的表面形貌 圖1所示為磁性SiO2納米顆粒固定化酶的表面形貌結構。從掃描電子顯微鏡圖中可以看出Fe3O4@SiO2比較規(guī)整的球形結構，分散性較好，平均粒徑在130 nm左右，顆粒的粒徑較小有利于漆酶的固定化。而Fe3O4@SiO2-PDA-Lac表面呈不規(guī)則的形態(tài)分布，顆粒間還產生了聚集現象，這是因為漆酶在納米顆粒上的固定化不是以直接共價結合的方式，而是借助于DA自聚合過程中的黏合作用來實現的，納米顆粒與酶分子通過這種作用力黏附在一起，從而形成了聚集體。

圖1 磁性SiO2納米顆粒固定化漆酶的掃描電鏡圖 Fig.1 SEM images of nanoparticles

圖2 Fe3O4@SiO2納米顆粒在水溶液中的粒徑分布圖 Fig.2 Size distribution of Fe3O4@SiO2nanoparticles

圖2為Fe3O4@SiO2納米顆粒在去離子水中的粒徑分布圖。其結果表明，制備的納米顆粒在去離 子水中呈單一分散，粒徑分布較均一，計算出的顆粒平均粒徑為134 nm。與掃描電鏡的測定結果基本一致。

2.1.2 磁性納米顆粒的磁性特征 圖3為Fe3O4納米顆粒在外加磁場作用下的沉降情況，可以看出，在外加磁場作用下，10 min內Fe3O4納米粒子90%發(fā)生沉降，該結果表明Fe3O4納米粒子在去離子水中具有良好的磁響應。因此，以磁性納米顆粒作為理想的載體來固定漆酶，不僅可以將漆酶從反應體系中加以回收利用，還能夠利用外加磁場調整固定化漆酶的運動方式，從而代替普通的攪拌方式并適用于產業(yè)化大規(guī)模使用。

圖3 Fe3O4納米顆粒在外加磁場作用下的沉降曲線 Fig.3 Precipitation curve of Fe3O4NPs in magnetic field

圖4 磁性納米顆粒的XRD圖 Fig.4 XRD patterns of nanoparticles

2.1.3 磁性納米顆粒的結構分析 圖4是Fe3O4納米顆粒和Fe3O4@SiO2納米顆粒的 XRD圖。從曲線a可以看出，制備的Fe3O4納米顆粒的主要衍射角分別位于30.1°、35.5°、43.1°、53.4°、57.0°和62.6°，和標準Fe3O4晶體的衍射角所對應的位置基本上是吻合的。Fe3O4納米顆粒的衍射峰依次對應于（220）、 （311）、（400）、（422）、（511）和（440）晶面，與標準Fe3O4晶體的衍射峰完全一致[20]，說明以高溫熱分解法所制備的Fe3O4納米顆粒具有較好的晶型結構。從曲線b可知，通過溶膠-凝膠法在Fe3O4納米顆粒表面包埋了一層SiO2殼層后，Fe3O4晶體的特征峰強度明顯下降，這是由于無定形結構的SiO2殼層覆蓋在Fe3O4納米顆粒的表面上，Fe3O4納米顆粒的結晶度下降所致。但是包埋了SiO2殼層的Fe3O4顆粒在XRD圖譜上的特征峰都出現了，說明顆粒的晶型結構沒有明顯的變化。

2.2 固定化漆酶活性及穩(wěn)定性

表1為優(yōu)化制備Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的正交實驗結果，通過以總酶活回收率為評價指標的參數估算和極差分析，得出影響Fe3O4@SiO2-PDA-Lac酶活回收率的因素主次關系為：溶液pH＞酶濃度＞固定化時間，得出制備Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的最優(yōu)條件是：溶液pH為6、酶濃度為0.25 mg·ml-1、固定化時間為18 h。在最優(yōu)固定化條件下，通過驗證得出的實際總酶活回收率為43.28%，與極差分析的預測值（40.79%）基本吻合，說明正交實驗優(yōu)化Fe3O4@SiO2-PDA-Lac的實驗結果是可靠的。相比于其他生物友好材料應用于漆酶的固定化方法[21-23]，本研究中利用多巴胺聚合固定化漆酶的總酶活回收率更高，具有更好的固定化效果。

表1 正交實驗所得固定化酶最佳條件 Table 1 Optimum parameters by optimization of orthogonal experiments

圖5所示是游離酶和Fe3O4-SiO2-PDA-Lac的熱穩(wěn)定性曲線。在50℃的恒溫水浴鍋中放置6 h后，Fe3O4-SiO2-PDA-Lac的活性保持在63%左右，相比固定化酶而言，游離酶在50℃條件下的活性下降更快，6 h后只保留了18%的活性。這是因為固定后的漆酶分子與納米顆粒之間的相互作用力使得漆酶的結構剛性增強，因而增加了它對環(huán)境的抗熱變性能，游離酶分子由于缺乏與載體之間的作用力，在高溫條件下容易引起失活。

2.3 固定化漆酶對CP的去除效果

圖5 游離漆酶和固定化漆酶在磷酸鹽緩沖液 （0.1 mol·L-1，pH 6.0）中的熱穩(wěn)定性 Fig.5 Thermal stability of free and immobilized laccase in PBS buffer (0.1 mol·L-1, pH 6.0) at 50℃ for 6 h

圖6 pH對游離漆酶和固定化漆酶去除4-CP的影響 Fig.6 Effect of pH on removing efficiency of 4-CP by free and immobilized laccase

2.3.1 溶液pH的影響 圖6所示為不同pH的反應體系中漆酶對4-CP去除率的影響。從圖中的結果可以看出，固定化漆酶反應的最適pH為6，對應 4-CP的去除率能達到84.3%，而游離漆酶反應的最適pH為5，對應4-CP的去除率只有65.7%。當溶液的pH在5～7之間時，固定化漆酶對4-CP的去除率均能保持在60%以上，對于游離酶來說，在pH為5～7之間，4-CP的去除率相對較低。在本研究中，由于多巴胺包埋磁性SiO2固定化漆酶的穩(wěn)定性較高，其在酸性及堿性環(huán)境下適應性均較好，所以對4-CP的去除效果明顯高于游離漆酶。

2.3.2 漆酶濃度的影響 圖7所示為不同濃度的游離漆酶和固定化漆酶對4-CP去除率的影響，結果顯示，隨著漆酶濃度從0.4 U·ml-1提高至1.2 U·ml-1，4-CP的去除率不斷提高，且隨著反應時間增加，所有體系的去除率均逐漸增加。當反應達到8 h后，1.2 U·ml-1的固定化漆酶對4-CP的去除率能達到95%。對于游離漆酶而言，在相同反應條件下，1.2 U·ml-1的游離酶對4-CP 的去除率僅為82%。這主要是由于游離酶在體系中很不穩(wěn)定，在 長時間的振蕩反應過程中，容易發(fā)生形變，導致活性損失，所以在長時間的催化反應過程中，游離漆酶對4-CP的去除效果反而低于固定化漆酶。

圖7 游離漆酶和固定化漆酶的濃度對4-CP去除率的影響 Fig.7 Effect of laccase concentration for removing 4-CP (4-CP: 10 mg·L-1at pH 5.0; temperature: 30℃)

2.3.3 ABTS的影響 從圖8可知，在未加入ABTS時，游離酶和固定化酶催化降解4-CP的速率較慢，反應10 min后，3.6 U·ml-1的游離酶和固定化酶對4-CP的去除率分別僅為54%和35%。當體系中加入ABTS時，反應10 min后，1.2 U·ml-1的游離酶和固定化酶分別能去除76%和96%的4-CP；3.6 U·ml-1的游離酶和固定化酶分別能去除96%和 99%的4-CP。由此可知，ABTS作為一種氧化還原介質可以促進漆酶對4-CP的去除，相比游離漆酶，ABTS對促進固定化漆酶去除4-CP的效果明顯要高。因此，以ABTS為介質的酶催化反應具有潛在的研究價值，為酶催化降解氯酚類物質提供了依據。

2.4 固定化漆酶的重復使用性

圖8 ABTS對游離漆酶和固定化漆酶去除4-CP的影響 Fig.8 Effect of ABTs concentration for removing 4-CP by free laccase and immobilized laccase

圖9 固定化漆酶在去除4-CP中的重復使用性 Fig.9 Reusability of immobilized laccase for removing of 4-CP at 30℃ (4-CP: 10 mg·L-1at pH 5.0; laccase concentration: 1.2 U·ml-1; reaction time: 2 h)

本實驗考察了固定化漆酶在去除4-CP實驗中的重復使用性，其結果如圖9所示。第一次使用時， 4-CP的去除率能達到85%，重復使用10次后，4-CP的去除率保持在67%左右，相當于固定化漆酶仍然保留了80%的催化活性。該結果表明，通過多巴胺的自聚合作用[24]，在氧化聚合的過程中將漆酶包埋在聚合層的里面，該聚合層對外界微環(huán)境的變化具有一定的抵抗作用，有利于固定化漆酶活性的保存，因此固定化漆酶具有較高的重復使用性。由于在酶催化降解過程中，產生的不溶性物質會增加酶與4-CP反應的位阻，影響酶的活性中心對底物的作用，從而導致酶的催化效率有一定的降低。

3 結 論

（1）通過溶膠-凝膠法制得的Fe3O4@SiO2納米顆粒，顆粒呈球狀分布而且平均尺寸為134 nm。可以在外加磁場的作用下迅速將磁性納米顆粒從反應體系中分離出來。通過最優(yōu)條件制備出的Fe3O4-SiO2-PDA-Lac固定化漆酶在50℃的恒溫中放置6 h后，活性保持在63%左右，而游離酶僅保留了18%的活性。

（2）固定化漆酶在反應最適pH時（pH=6），能催化降解84.3%的4-CP，而游離漆酶在反應最適pH時（pH=5），4-CP的去除率僅為65.7%。

（3）隨著體系中漆酶濃度的增加，4-CP的去除率不斷增大，當反應達到8 h時，1.2 U·ml-1的固定化漆酶對4-CP的去除率可達95%，對于游離漆酶而言，在相同條件下，4-CP的去除率僅82%，說明固定化漆酶催化降解4-CP的效果優(yōu)于游離漆酶。

（4）當體系中加入ABTS時，反應10 min后，3.6 U·ml-1的游離酶和固定化酶對4-CP的去除率分別為96%和99%，由此可知，ABTS作為一種反應介質可以促進漆酶對4-CP的去除，相比游離漆酶，ABTS對促進固定化漆酶去除4-CP的效果明顯要高。

（5）在重復使用10次后，固定化漆酶對4-CP的去除率仍然保持在67%左右，相當于固定化漆酶還保留了80%的初始催化活性，該結果表明固定化漆酶具有較高的操作穩(wěn)定性和重復使用性，為實現工業(yè)化應用提供了有力的依據。

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