王小艷，樊艷爽，韓蓓佳，馮旭東，李春,

（1天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072；2北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

引 言

大量研究表明糖基化是調(diào)節(jié)酶活性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素，可以賦予許多蛋白質(zhì)有益屬性和功 能[1-4]。蛋白質(zhì)經(jīng)糖基修飾后能避免熱力學(xué)降解，提高其熱穩(wěn)定性，而天然糖基化蛋白質(zhì)的糖基側(cè)鏈的去除會(huì)降低其熱力學(xué)穩(wěn)定性，從而增加蛋白質(zhì)聚集的可能性[5-6]。例如，糖基化在維持組織蛋白酶E穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用，潛在糖基化位點(diǎn)的去除導(dǎo)致了組織蛋白酶E對熱和酸穩(wěn)定性的下降[7]。Fonseca- Maldonado等[8]發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母中重組表達(dá)的糖基修飾的木聚糖酶與大腸桿菌中表達(dá)的未發(fā)生糖基化的對照酶相比熱穩(wěn)定性得到顯著提高。研究表明，糖基化可提高彈性蛋白酶rPAEd 在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，使其在70℃時(shí)的半衰期延長至32.2 min, 與未糖基化的對照（23.1 min）相比熱穩(wěn)定性有了顯著改善[5]。另外，由于糖鏈自身的親水性，經(jīng)過糖基化修飾后蛋白質(zhì)的水溶性可能會(huì)發(fā)生變化，有利于一些糖蛋白的分泌[9]。由于糖基化具有賦予蛋白質(zhì)有益特性和功能的潛力，近年來糖基化在蛋白質(zhì)改造方面得到越來越廣泛的關(guān)注。

真核生物中N-糖基化識別位點(diǎn)主要有N-X-T和N-X-S兩種形式，研究發(fā)現(xiàn)N-X-T結(jié)構(gòu)比N-X-S結(jié)構(gòu)更容易被糖基化[10]。但很多自然界蛋白質(zhì)存在自身含有的潛在糖基化位點(diǎn)并未被糖基修飾的現(xiàn)象，有研究表明，位于蛋白結(jié)構(gòu)反向轉(zhuǎn)角區(qū)上的糖基化位點(diǎn)天冬酰胺前面2～3個(gè)位置的氨基酸為苯丙氨酸時(shí)，有利于芳香族側(cè)鏈和糖鏈的N-乙酰葡糖胺相互作用，從而提高糖基化效率，該特征氨基酸序列主要有3種形式：F-N-X-T、F-X-N-X-T和F-X-X-N-X-T，具有該特征的序列被稱為EAS（enhanced aromatic sequon）序列[11-12]。而隨著對糖基修飾和糖蛋白之間關(guān)系的研究，發(fā)現(xiàn)將N-糖鏈引入蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)亩壗Y(jié)構(gòu)中能增加其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此通過定點(diǎn)突變來減少或增加糖基化位點(diǎn)，對探索N-糖基化對全局糖蛋白的影響是一種有效手段。

β-葡萄糖醛酸苷酶（GUS，EC 3.2.1.31）屬于糖苷酶，大部分屬于糖基水解酶第二家族，它能催化各種類型的β-葡萄糖醛酸苷水解產(chǎn)生多種衍生物同時(shí)釋放出β-葡萄糖醛酸[13]。相關(guān)研究表明，該酶可以轉(zhuǎn)化甘草酸（GL）生成單葡萄糖醛酸甘草次酸（GAMG）[14-18]，且與GL相比，GAMG具有極性適中、安全性更高及生物利用度更高等優(yōu)點(diǎn)，更能滿足工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的需求。前期將來自Penicillium purpurogenumLi-3菌中的β-葡萄糖醛酸苷酶在畢赤酵母中重組表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了糖基修飾，而經(jīng)糖基修飾后的β-葡萄糖醛酸苷酶（PGUS-P）的熱穩(wěn)定性與野生型相比得到明顯提高[19]。

考慮到糖基化對糖蛋白熱穩(wěn)定性的顯著影響，本研究以PGUS-P為研究對象，基于結(jié)構(gòu)模擬對其進(jìn)行半理性設(shè)計(jì)，通過定點(diǎn)突變技術(shù)在該酶的氨基酸序列中引入具有EAS序列的新N-糖基化位點(diǎn)，并對突變酶進(jìn)行活性檢測和糖基化驗(yàn)證，同時(shí)對突變酶的催化特性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期得到含有不同位點(diǎn)糖基化的熱穩(wěn)定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶，同時(shí)也為將來對其他工業(yè)用酶穩(wěn)定性的改造提供一種新思路和理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

表達(dá)宿主畢赤酵母P.pastorisGS115和大腸桿菌BL21（DE3）Star為本實(shí)驗(yàn)室自行保藏。用于分子克隆實(shí)驗(yàn)的克隆宿主為（E.coli）Top10購自博邁德公司，畢赤酵母和大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒模板為潛在糖基化位點(diǎn)突變了的pGAPZ-Pgus-ungly和pET28a-Pgus-ungly（圖1），為實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建保存。

圖1 質(zhì)粒示意圖 Fig.1 Schematic diagram of plasmid

1.2 酶和試劑

PCR相關(guān)試劑如rTaq DNA聚合酶等購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司；限制性內(nèi)切酶，如BlnI、DpnI等購自TaKaRa公司。

1.3 微生物的培養(yǎng)

大腸桿菌的培養(yǎng)：采用 LB培養(yǎng)基，37℃，搖床轉(zhuǎn)速170 r·min-1時(shí)培養(yǎng)12 h。

畢赤酵母P.pastorisGS115的培養(yǎng)：采用YPD培養(yǎng)基，30℃，搖床轉(zhuǎn)速170 r·min-1，培養(yǎng)3 d。

1.4 定點(diǎn)突變

①以質(zhì)粒為模板，利用表1中的引物克隆整個(gè)質(zhì)粒，同時(shí)在目標(biāo)基因上引入突變位點(diǎn)；②PCR產(chǎn)物可直接利用DpnI消化甲基化或半甲基化的模板；③將酶切產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中；④篩選到陽性克隆、測序正確后將質(zhì)粒在表達(dá)宿主中表達(dá)。

表1 引物序列表 Table 1 Primers sequence table

1.5 突變酶的表達(dá)

大腸桿菌的表達(dá)體系構(gòu)建與突變酶的表達(dá)參照Merck Novagen 的pET表達(dá)系統(tǒng)說明書。

畢赤酵母P.pastorisGS115的表達(dá)體系構(gòu)建與突變酶的表達(dá)根據(jù)Invitrogen公司pGAPZ表達(dá)載體操作手冊進(jìn)行操作。

1.6 重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

大腸桿菌表達(dá)蛋白的純化采用Ni Fast Flow鎳柱親和色譜柱進(jìn)行；畢赤酵母表達(dá)蛋白的純化采用Q Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行；蛋白質(zhì)的丙酮沉淀，向培養(yǎng)基中加入等體積的預(yù)冷的丙酮，輕輕混勻后，4℃，12000 r·min-1離心10 min，收集蛋白沉淀，最后加入適量的緩沖液溶解蛋白。SDS-PAGE分析，樣品處理：取樣品40 μl加入10 μl蛋白上樣緩沖液重懸，在沸水浴中煮沸5 min后離心后取上清電泳；制膠，參考說明書配制10%的分離膠和5%的濃縮膠；電泳：初始電壓控制在80 V，等樣品泳過濃縮膠后將電壓調(diào)節(jié)到120 V直至電泳結(jié)束；染色和脫色：將凝膠剝下后用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色1 h，然后用脫色液脫色，期間換脫色液1～2次，脫色充分后拍照保存。

1.7 糖蛋白PAS染色

PAS（ periodic acid-Schiff’s base method）染色方法：利用品紅的高碘酸-希夫試劑，通過對糖鏈染色來檢測糖蛋白的存在。取出SDS-PAGE后的凝膠，將其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1～2 h以固定蛋白條帶；然后將固定后的凝膠取出用5%的冰醋酸清洗2次，每次10 min；然后把凝膠浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中，在4℃中黑暗條件下氧化1 h；用5%冰醋酸將凝膠漂洗幾次后，用50 ml的偏重亞硫酸鈉溶液（0.2 g偏重亞硫酸鈉溶于100 ml 5 %冰醋酸）浸泡10 min；用Schiff試劑于4℃避光染色1 h；染色完畢后將凝膠用大量5%冰醋酸進(jìn)行清洗，即可見紅色糖蛋白電泳條帶。

1.8 糖蛋白糖苷酶F酶法

糖苷酶F酶切條件如下：①20 μg糖蛋白在1×糖蛋白變性緩沖液中，100℃煮沸10 min，使糖蛋白變性。②加入1/10體積的10×G7緩沖液及10% NP-40。③加入1～5 μl PNase F，37℃溫育1 h，將酶切后樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.9 β-葡萄糖醛酸苷酶的活性測定

以硝基苯-葡萄糖醛酸苷（p-NPG）為底物的 酶活測定：取10 μl酶液加40 μl p-NPG（1.25 mmol·L-1）最適溫度下反應(yīng)10 min后，加入200 μl、0.4 mol·L-1的碳酸鈉終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀（405 nm）檢測樣品溶液中對硝基苯酚的含量。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義：一個(gè)活力單位（U）為上述條件下，每分鐘催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

以甘草為底物的酶活測定：取100 μl 酶液與400 μl甘草酸緩沖溶液反應(yīng)，一定溫度下反應(yīng)一段時(shí)間后，沸水浴處理10 min使酶失活，樣品與甲醇的混合比例為1:9，用HPLC檢測GL、GAMG 和GA 的含量。采用高效液相色譜外標(biāo)法對甘草酸、GAMG 和甘草次酸進(jìn)行測定，儀器設(shè)置參數(shù)為：島津LC-10A，色譜柱：Shim-pack，VP-ODS，檢測器：SPD，檢測波長：254nm，流動(dòng)相：甲醇:0.6%乙酸=81:19，進(jìn)樣量：10 μl，流速：1 ml·min-1，柱溫箱：40℃，工作站：LCsolution。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為：在一定條件下，每分鐘消耗1 nmol 的甘草酸所需要的酶量為一個(gè)活力單位。

1.10 突變酶催化特性的測定

溫度穩(wěn)定性：將β-葡萄糖醛酸苷酶液放于65℃水浴中保溫，分別在不同時(shí)間間隔取樣，測定剩余酶活力，以初始酶活作為參照，確定β-葡萄糖醛酸苷酶的溫度穩(wěn)定性。

動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測定：在最適pH條件下配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 g·L-1的甘草酸溶液，取一定量的酶液與甘草酸溶液在40℃反應(yīng)，10 min后，進(jìn)行酶活檢測。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.11 結(jié)構(gòu)模擬分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模，模板選取已經(jīng)公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)（PDB編號：3K46）[20]，結(jié)構(gòu)顯示分析均采用PyMol軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 N-糖基化位點(diǎn)的設(shè)計(jì)

根據(jù)PGUS-P氨基酸序列（Genebank 登錄號為EU095019），對其一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析選取目標(biāo)N-糖基化位點(diǎn)。首先，為提高新糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基修飾的可能性，選擇最易將其突變成為具有EAS（enhanced aromatic sequence）序列特征的糖基化位點(diǎn)，其次兼顧改變較少氨基酸即可形成EAS序列的原則，初期選取了10個(gè)目標(biāo)N-糖基化位點(diǎn)。

為進(jìn)一步分析新設(shè)計(jì)的糖基化位點(diǎn)是否合理，以已經(jīng)公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)為模板（PDB編號：3K46）[20]，利用SWISS-MODEL對PGUS-P的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，并結(jié)合PyMOL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件對PGUS-P三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示與分析。從蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上來說，糖基化在loop/turn區(qū)發(fā)生概率較高[21]，進(jìn)一步從初期選取的10個(gè)目標(biāo)N-糖基化位點(diǎn)中選取位于loop/turn區(qū)的突變位點(diǎn)；而從蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)上分析，避免選取位于蛋白質(zhì)亞基結(jié)合面，且靠近活性中心的序列，最終確定了3個(gè)位于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)表面且遠(yuǎn)離活性中心同時(shí)位于loop/turn區(qū)的目標(biāo)序列突變?yōu)镋AS序列，其突變序列見表2，這3個(gè)新的糖基化位點(diǎn)在PGUS-P蛋白結(jié)構(gòu)上的位置分布情況如圖2所示。

表2 目標(biāo)突變序列 Table 2 Targeted sequon

從圖2中可見，1號目標(biāo)突變EAS序列位于氨基酸序列的26～30之間，該段氨基酸序列位于PGUS-P三維結(jié)構(gòu)中的糖基結(jié)合保守域，將其命名為PGUS-P-26；同樣位于該區(qū)域的還有2號目標(biāo)突變EAS序列（氨基酸序列35～39），將其命名為PGUS-P-35；而3號（命名為PGUS-P-259）則位于免疫球蛋白β-三明治狀結(jié)構(gòu)域。

圖2 突變位點(diǎn)在β-葡萄糖醛酸苷酶三維結(jié)構(gòu)上的位置分布 Fig.2 Location of EAS on subunit form of PGUS-P (a) [E414 and E505 (labeled in red) were two presumed activity catalytic residues] and location of EAS on tetramer form of PGUS-P (b)

圖3 PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259與PGUS-P蛋白結(jié)構(gòu)比對 Fig.3 Structural alignment of mutant enzymes and PGUS-P (Red and yellow represent sequence before and after mutation, respectively)

為考察3個(gè)目標(biāo)突變位點(diǎn)氨基酸的突變是否引起PGUS-P結(jié)構(gòu)的改變，利用SWISS-MODEL將突變后的序列重新建模，將PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259建模后的結(jié)構(gòu)與PGUS-P進(jìn)行疊合比對，分析新糖基化位點(diǎn)對β-葡萄糖醛酸苷酶本身結(jié)構(gòu)的影響。疊合比對結(jié)果如圖3所示，由圖3可以看出，與PGUS-P結(jié)構(gòu)相比，只有PGUS-P-26的氨基酸改變導(dǎo)致了蛋白局部結(jié)構(gòu)的變化，但并未引起蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化，而PGUS-P-35和PGUS-P-259的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在氨基酸改變前后并未發(fā)生變化。進(jìn)一步說明新設(shè)計(jì)的3個(gè)糖基化位點(diǎn)進(jìn)行N-糖基修飾是合理可行的。

2.2 突變酶的表達(dá)及糖基化驗(yàn)證

選擇了適度甘露糖糖鏈的畢赤酵母對目標(biāo)突變序列進(jìn)行糖基修飾的底盤宿主，同時(shí)選擇了組成型分泌表達(dá)載體pGAPZa通過定點(diǎn)突變成功構(gòu)建了3個(gè)突變酶的畢赤酵母表達(dá)體系。經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)后利用丙酮沉淀法對培養(yǎng)液上清中的蛋白進(jìn)行初步濃縮，用SDS-PAGE進(jìn)行檢測目標(biāo)蛋白是否表達(dá)，從圖4的結(jié)果可以看出，3個(gè)突變酶均獲得了成功表 達(dá)，突變酶蛋白條帶大小均與原始PGUS-P的蛋白分子量大小相同。

圖4 突變酶SDS-PAGE檢測分析 Fig.4 SDS-PAGE of crude enzyme from Picha pastoris

為驗(yàn)證3個(gè)含有新N-糖基化位點(diǎn)的突變酶是否都成功引入糖基修飾，首先選擇糖蛋白分析中較為常用的PAS染色。將SDS-PAGE后的凝膠進(jìn)行PAS染色，從3個(gè)突變酶的PAS染色結(jié)果[圖5（a）]中可以看出，PGUS-P及3個(gè)突變酶均能觀察到紫紅色條帶，而大腸桿菌中表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E泳道則沒有紫紅色條帶出現(xiàn)。為了進(jìn)一步觀察目標(biāo)條帶的變化，將PAS染色后的凝膠重新進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果如圖5（b）所示，經(jīng)藍(lán)染后，目標(biāo)位置出現(xiàn)明顯條帶，而原本無條帶的PGUS-E也出現(xiàn)藍(lán)色條帶。以上結(jié)果可以初步確定3個(gè)突變體均成功引入糖基化修飾。

為了更進(jìn)一步確認(rèn)突變酶發(fā)生了糖基修飾，采用了糖苷酶F作為去糖鏈劑來處理目標(biāo)酶樣品。酶切前后樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE，檢測糖苷酶處理前后分子量變化，SDS-PAGE結(jié)果見圖6。從結(jié)果中可以看出，3個(gè)突變酶糖苷酶F酶切前后條帶均發(fā)生遷移，表明酶切后由于糖鏈的去除，分子量發(fā) 生了變化。酶切前大小與自身含有糖基化的PGUS-P一致，而酶切后大小則與無糖基化的PGUS-E大小保持一致，糖苷酶F酶切結(jié)果表明3個(gè)突變酶均發(fā)生了糖基修飾。

圖5 突變酶的PAS染色 Fig.5 SDS-PAGE of mutants stained by PAS

圖6 糖苷酶F處理前后SDS-PAGE電泳圖 Fig.6 SDS-PAGE analysis of mutant enzymes treated with/without PNGase F

2.3 突變酶的催化特性分析

為檢測獲得的突變酶是否具有活性，對純化得到的突變酶樣品進(jìn)行了以p-NPG為底物的酶活檢查，如圖7所示，發(fā)現(xiàn)不同糖基化位點(diǎn)比酶活呈現(xiàn)較大差異。PGUS-P -35的比酶活為141.5 U·mg-1，明顯高于對照PGUS-P的106.1 U·mg-1，PGUS-P-259與PGUS-P相比也有所提高，為125.5 U·mg-1，而PGUS-P-26的比酶活卻下降為60.07 U·mg-1。此種現(xiàn)象可能與發(fā)生糖基化的位點(diǎn)不同有關(guān)系，PGUS-P-26的突變位點(diǎn)的糖基修飾可能影響到了酶的正?；钚詫?dǎo)致其比酶活下降。Miller等曾報(bào)道過當(dāng)把endothelial lipase（EL）的N373、N449和N471位的糖鏈去除后，EL的酶活降低了70%，但去除N62位的糖鏈，EL的酶活反而提高了5倍[22-23]，也說明了不同糖基化位點(diǎn)對酶活的影響不同。

圖7 畢赤酵母表達(dá)突變酶的比酶活測定 Fig.7 Specific activity analysis of mutant enzymes expressed in P.pastoris

利用HPLC分析考察了突變酶水解甘草酸模式（催化特異性）有無發(fā)生變化，圖8顯示了各突變酶水解甘草酸反應(yīng)的結(jié)果。甘草酸（GL）為底物，產(chǎn)物為單葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）和甘草次酸（GA），三者的保留時(shí)間分別為5.2 min，11.6 min和21.3 min[24]。從圖8的結(jié)果可以看出，PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對甘草酸的水解模式均未發(fā)生變化，與對照PGUS-P一樣生成GAMG和GA兩種產(chǎn)物。表明不同位點(diǎn)糖基化修飾不會(huì)改變?chǔ)?葡萄糖醛酸苷酶的催化反應(yīng)類型。該結(jié)論與江南大學(xué)余曉斌課題組報(bào)道的N-糖基化對彈性蛋白酶的底物特異性沒有顯著影響是一致的[5]。

圖8 突變酶水解甘草酸(GL)的模式 Fig.8 Hydrolysis of glycyrrhizin by mutant enzymes

表3 突變酶與甘草酸反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)常數(shù) Table 3 Kinetic parameters of mutant enzymes in GL hydrolysis

大多數(shù)情況下，發(fā)生了N-糖基化的蛋白質(zhì)的催化特性要優(yōu)于與其對應(yīng)的沒有被糖基修飾的蛋白，盡管有時(shí)候糖基修飾并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的顯著改變[25]。糖鏈的添加可能通過影響酶蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)域與催化殘基的相互作用來影響酶與底物之間的親和力[26]。為了考察新引入糖基修飾的突變酶在實(shí)際催化反應(yīng)體系中的催化性質(zhì)，采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計(jì)算酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Km，Vmax，Kcat，Kcat/Km），結(jié)果如表3所示。PGUS-P-35的最大反應(yīng)速率Vmax與PGUS-P相比得到提高，為120.48 μmol·(L·min)-1。三者的Km和Kcat與PGUS-P相比均減小，說明新引入的糖基化不同程度地提高了β-葡萄糖醛酸苷酶與甘草酸底物的親和力，可能是糖基修飾使得酶蛋白空間構(gòu)象更有利于底物的結(jié)合，而且3株突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259的Kcat/Km與PGUS-P相比分別提高了30.1%，23.9%和12.6%，表明其催化底物甘草酸的效率同時(shí)也得到提高。

2.4 突變酶熱穩(wěn)定性分析

大量研究表明，N-糖基化可以提高蛋白的穩(wěn)定性，其原因主要有兩個(gè)：一是糖鏈的形成可以降低未折疊蛋白的無序度，即提高了一些未折疊的糖蛋白的穩(wěn)定性；二是由于糖鏈本身是一些分子量較大的親水基團(tuán)，會(huì)增加蛋白的可溶性并且有利于抑制蛋白聚集體的形成[27]。另外，也有研究表明，雖然有時(shí)候一些糖蛋白的糖基化并沒有顯著改變蛋白的二級結(jié)構(gòu)，但會(huì)減緩其熱失活過程，一定程度上抑制了熱變性過程中蛋白的聚集[28]，這也進(jìn)一步證明了糖基化可提高蛋白穩(wěn)定性。為驗(yàn)證不同位點(diǎn)新引入的N-糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶熱穩(wěn)定性的影響，首先在大腸桿菌中表達(dá)了相應(yīng)的含有這3個(gè)突變序列的 β-葡萄糖醛酸苷酶，分別命名為PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259，然后同時(shí)考察了有糖基修飾的PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259和無糖基修飾的 PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259在65℃時(shí)的熱穩(wěn)定性。將酶液置于65℃水浴中，每隔30 min時(shí)間間隔取樣，測定酶活，以保溫前的酶活為對照并記為100%，測定結(jié)果如圖9所示。

在65℃保溫時(shí)，糖基化突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259的熱穩(wěn)定性與對照PGUS-P相比得到提高。65℃保溫90 min時(shí)，二者剩余酶活力分別維持在95%和93%，而PGUS-P剩余酶活為84%左右。但PGUS-P-26在65℃ 保溫90 min時(shí)的剩余酶活僅為74%左右。繼續(xù)延長保溫時(shí)間可以發(fā)現(xiàn)，PGUS-P-35，PGUS-P-259兩突變體的剩余酶活下降非常緩慢，3 h后仍然保留高達(dá)85%以上的剩余酶活，而PGUS-P只保留70%以上的酶活。且糖基化系統(tǒng)中表達(dá)的 PGUS-P-26，PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩(wěn)定性均顯著高于非糖基化系統(tǒng)中的表達(dá)的相應(yīng)酶，上述結(jié)果表明糖基修飾提高了該酶的熱穩(wěn)定性。

此外，從圖9（a）可以看出，PGUS-E-26與其對照PGUS-E相比提高約10%，表明該位點(diǎn)的氨基酸突變有利于熱穩(wěn)定性的提高，但糖基修飾的PGUS-P-26的熱穩(wěn)定性卻低于對照PGUS-P，原因可能是該位點(diǎn)的糖基修飾影響了酶的局部結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低。而PGUS-E-35和PGUS-E-259的熱穩(wěn)定性與PGUS-E相比并未有顯著變化趨勢[圖9（b），（c）]，說明相應(yīng)位點(diǎn)的氨基酸突變對穩(wěn)定性影響不大，但糖基修飾的PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩(wěn)定性與對照PGUS-P相比明顯提高，進(jìn)一步說明二者的熱穩(wěn)定性提高確實(shí)是由引入的糖基化引起的。上述結(jié)果表明糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性有顯著影響，且不同位點(diǎn)的糖基化對該酶的影響有明顯差異，這與文獻(xiàn)中報(bào)道的不同位點(diǎn)上的糖基化對酶具有明顯不同影響的結(jié)論是一致的[8]。

3 結(jié) 論

本研究以糖基修飾作為一種新的酶穩(wěn)定性改造手段，以畢赤酵母重組表達(dá)PGUS-P為研究對象，在對PGUS-P結(jié)構(gòu)模擬的基礎(chǔ)上，采用半理性設(shè)計(jì)方法對其進(jìn)行糖基改性，利用定點(diǎn)突變方法在β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列中引入3個(gè)具有EAS序列的新N-糖基化位點(diǎn)，經(jīng)活性檢測和PAS染色及糖苷酶F酶切分析，獲得了糖基修飾的突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35、PGUS-P-259。研究發(fā)現(xiàn)引入糖基化后得到了穩(wěn)定性優(yōu)良的兩株突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259，65℃ 保溫90 min時(shí)，二者剩余酶活力分別維持在95%和93%；而PGUS-P-26的熱穩(wěn)定性無明顯變化，推測可能與之前模擬的該位點(diǎn)氨基酸的改變引起其結(jié)構(gòu)的細(xì)微改變有關(guān)。此外，引入糖基化后，PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對底物甘草酸的親和力均增加，催化效率分別提高了30.1%，23.9%和12.6%。本研究初步探究糖基化的位點(diǎn)對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及催化特性的影響，推測位于turn/loop區(qū)的糖鏈的添加可能會(huì)在一定程度上影響到一些loop環(huán)的柔性，從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的剛性。

圖9 突變酶熱穩(wěn)定性分析 Fig.9 Thermostability analysis of mutant enzymes

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