熊俐，谷良富

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

雙酶法預處理對菜籽餅多酚提取的影響

熊俐，谷良富

（四川理工學院生物工程學院，四川自貢643000）

用纖維素酶和蛋白酶對菜籽餅進行復合預處理，然后用乙醇浸提其中的多酚，研究酶解對多酚提取率的影響。結果表明雙酶法預處理的最佳條件為：纖維素酶添加量1.4%，蛋白酶添加量0.7%，反應溫度50℃，反應時間3 h，酶解初始pH5.4，多酚的得率為3.12%。較之非酶解法，雙酶法對多酚的提取率提高了約54.46%。

菜籽餅；多酚；纖維素酶；蛋白酶；提取

油菜籽是世界第三大油料作物。我國年產油菜籽1 100萬t～1 200萬t，油菜籽經(jīng)壓榨制油后產生的菜籽餅每年超過500萬t，居世界首位[1-2]。茶籽餅中富含蛋白質、糖類、粗纖維及礦物質，同時含有硫代葡萄糖苷、植酸及單寧等多酚類物質。多酚類物質會與蛋白、金屬離子等營養(yǎng)物質相結合，降低菜籽餅的營養(yǎng)價值，還會產生苦味、澀味等，極大的影響菜籽餅的口感。因此，在早期利用菜籽餅開發(fā)產品時，通常會通過有機溶劑浸提或微生物發(fā)酵等方式將多酚加以除去[3-4]。后來的研究表明菜籽多酚具有較強的還原能力，能清除自由基，提高生物體的免疫力[5-6]，對芝麻油和豬油在貯藏及油炸過程中有明顯的抗氧化效果[7-8]，是一種極具開發(fā)價值的天然抗氧化劑。因此，對菜籽餅多酚進行分離、純化，并加以利用，可以提高菜籽餅粕的綜合利用價值。

菜籽餅中的酚類物質有3種存在形式：游離型的酚酸，可溶性酚，以及與蛋白質、糖等組成的不溶性化合物。其中游離態(tài)的酚酸最少，絕大多數(shù)酚類化合物以不溶解的結合狀態(tài)存在，這給多酚的提取帶來了困難。酚類物質的提取方法有很多，最常用的是溶劑提取，它不需要特殊的設備，操作簡單易行，但同時也存在處理時間長、提取效率低等缺點。因此出現(xiàn)了一些輔助提取的方法，如酶、超聲波、微波等輔助提取[9-10]。酶輔助提取技術通過酶反應將影響提取的雜質分解除去，加速有效成分的釋放，具有快速、高效、反應條件溫和、專一性強等諸多優(yōu)點，已越來越廣泛應用于動植物原料中有效成分的提取。本實驗采用復合酶解（纖維素酶和蛋白酶）技術輔助乙醇溶劑法，從菜籽餅中提取多酚，以菜籽多酚的提取率為參考指標，探求酶法輔助乙醇提取多酚的最佳工藝條件，為菜籽餅茶多酚的提取和籽餅粕的綜合利用提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料

菜籽餅購自自貢某菜籽油壓榨廠，樣品經(jīng)50℃烘12 h左右后，磨細過40目篩備用。纖維素酶，酶活力為2萬u/mg～15萬u/mg，溫度范圍20℃～55℃，pH 4.0～6.5；酸性蛋白酶，酶活力為10萬u/mg～40萬u/mg，溫度范圍20℃～55℃，pH 3.0～5.5，2種酶均來自寧夏和氏璧生物技術有限公司，為食品級。

1.1.2 藥品

乙醇、單寧酸標準品、醋酸、醋酸鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、碳酸鈉和石油醚（30℃～60℃沸程）等，均為分析純。

1.1.3 試劑

醋酸-醋酸鈉緩沖液，F(xiàn)olin-Ciocalteu顯色試劑。1.1.4儀器

752 型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器公司；HHS-6型電熱恒溫水浴鍋：上海衡平儀表儀器；AR1140型電子分析天平：奧豪斯國際貿易上海公司；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：上海市東璽制冷儀器設備有限公司；LGJ0.2型冷凍干燥機：上海醫(yī)用分析儀器；MZ10型中藥粉碎機：青島邁科隆粉體技術設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總工藝流程

菜籽餅→干燥→粉碎、過40目篩→石油醚脫脂→酶解→乙醇提取→抽濾→冷凍干燥→多酚成品

1.2.1.1 酶解

取5 g菜籽餅樣品于100 mL三角瓶中，加入一定量的纖維素酶和蛋白酶，再加入一定pH的醋酸-醋酸鈉緩沖液18 mL，用保鮮膜封口，恒溫水浴加熱處理一段時間后，70℃水浴加熱10 min使酶失活。

1.2.1.2 乙醇提取

參照湯務霞[11]的方法。取42 mL無水乙醇加入酶失活后的酶解液中（使得乙醇體積分數(shù)為70%、并且料液比為1∶12），用醋酸調節(jié)初始pH為3，用保鮮膜封口，水浴恒溫52℃加熱50 min，將浸提液減壓抽濾。濾渣再用70%的乙醇溶液60 mL重復浸提1次。合并2次濾液，冷凍干燥制備多酚成品。

1.2.2 菜籽多酚含量的測定

用改良后的Folin-Ciocalteu法（相關數(shù)據(jù)已投稿、還未發(fā)表）測定菜籽多酚含量，以單寧酸作為標準物。

1.2.2.1 改良后的Folin-Ciocalteu法

吸取1 mL的待測樣品，放入25 mL容量瓶內，加10 mL 70%乙醇，搖勻，加入2.5 mL的顯色劑和4 mL的飽和Na2CO3溶液，并用70%乙醇定容至25 mL，在40℃下避光反應50 min后，以70%乙醇做空白對照，在757 nm波長下測定吸光值。

1.2.2.2 標準曲線的繪制

配制1.0mg/mL的單寧酸標準溶液，分別取0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45和0.5 mL標樣，按照改良后的Folin-Ciocalteu法進行顯色反應，檢測其吸光度A，以吸光值與加入的標樣量作線性回歸分析，得到回歸方程為y=8.637 5x+0.004 9，x表示濃度（mg/L），y表示吸光度，相關系數(shù)R2為0.993 7。

1.2.2.3 菜籽餅多酚含量的測定

將分離得到的菜籽餅多酚干品用70%的乙醇溶液溶解、并定容至100 mL，確定其濃度在標準曲線線性范圍內。再吸取1 mL移入25 mL容量瓶，按照改良后的Folin-Ciocalteu法進行顯色反應，檢測其吸光度A。根據(jù)公式計算提取率，公式如下：

菜籽餅多酚提取率/%=[（A-0.004 9）×100×25× 100]/8.637 5×1 000×5

1.3試驗設計

1.3.1 雙酶法預處理的研究

1.3.1.1 單因素試驗

設計單因素試驗，以多酚提取率為指標，研究纖維素酶添加量、蛋白酶添加量、酶解pH、酶解溫度和酶解時間對菜籽餅多酚提取的影響。

纖維素酶添加量的選擇：在初始pH 5.0，溫度50℃，時間3 h，蛋白酶添加量0.5%的條件下，考察不同纖維素酶添加量（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%）對多酚提取率的影響。

蛋白酶添加量的選擇：在初始pH 5.0，溫度50℃，時間3 h，纖維素酶添加量1.6%的條件下，考察不同蛋白酶添加量（0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%和1.0%）對多酚提取率的影響。

初始pH的選擇：在溫度50℃，時間3 h，蛋白酶添加量0.7%，纖維素酶添加量1.6%的條件下，考察不同初始pH（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8）對提取率的影響。

溫度的選擇：在初始pH 5.4，時間3 h，蛋白酶添加量為0.7%，纖維素酶添加量為1.6%的條件下，考察不同溫度（30、35、40、45、50、55、60、65℃）對多酚提取率的影響。

時間的選擇：在溫度50℃、初始pH5.4，蛋白酶添加量0.7%，纖維素酶添加量1.6%的條件下，考察不同酶解時間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5 h）對多酚提取率的影響。

1.3.1.2 正交試驗

根據(jù)單因素實驗，選取對多酚提取率有主要影響的因素（纖維素酶添加量、蛋白酶添加量、溫度、時間），設計四因素三水平L9（34）進行正交試驗，優(yōu)化酶解預處理的工藝參數(shù)。因素三水平L9（34）正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1Factors and levels of orthogonal test

1.3.1.3 工藝驗證

根據(jù)正交實驗中得出的最佳酶解工藝條件，設計3個平行實驗，對其進行驗證。

1.3.2 酶解法與非酶解法的比較

分別取非酶解處理的樣品和經(jīng)最佳酶解工藝處理過的樣品各3個，采用湯務霞[11]的方法提取多酚，比較兩種方法對菜籽多酚提取率的影響。

2 結果與分析

2.1 雙酶法預處理

2.1.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1.1 纖維素酶添加量的選擇

纖維素酶添加量對菜籽餅多酚提取的影響見圖1。

圖1 纖維素酶添加量對多酚提取率的影響Fig.1 The influence of cellulase adding on polyphenol extraction rate

當纖維素酶液濃度在0.6%～1.6%范圍時，菜籽餅多酚提取率隨酶添加量的增加而增加，當纖維素酶量為1.6%時，多酚提取率最高（為2.47%），之后雖然酶量繼續(xù)增加了，但多酚提取率基本保持穩(wěn)定，因此認為適宜的纖維素酶添加量為1.6%。纖維素酶可破壞植物的細胞壁與細胞間質，促使多酚等胞內物質快速擴散溶出，提高有效成分的提取率，但當酶解反應完全、多酚充分提取出來以后，繼續(xù)增加酶量，對提取率的影響不大。另一方面，在較低的酶濃度下，酶與底物尚可較充分地結合；隨著酶濃度的升高，底物濃度不能對酶達到飽和，導致酶的作用受到抑制，所以對一定的底物濃度均存在一個最佳酶用量，并非酶越多酶解效果就越好。

2.1.1.2 蛋白酶添加量的選擇

蛋白酶添加量對菜籽餅多酚提取的影響見圖2。

當?shù)鞍酌敢簼舛仍?.3%～0.8%范圍時，菜籽餅多酚提取率隨著酶添加量的增加而增加，當纖維素酶量為0.8%時，多酚提取率最高（為2.58%），之后，雖然酶量增加了，但多酚提取率基本保持不變，因此認為適宜的蛋白酶添加量為0.8%。蛋白酶可降解菜籽餅中的蛋白質，從而釋放其所吸附的多酚，但當酶添加量達到一定程度之后，酶與底物的作用飽和，再加大酶量所產生的作用也很小。

圖2 蛋白酶添加量對多酚提取率的影響Fig.2 The influence of protease adding on polyphenol extraction rate

2.1.1.3 初始pH的選擇

初始pH對菜籽餅多酚提取的影響見圖3。

圖3 初始pH對多酚提取率的影響Fig.3 The influence of initial pH on polyphenol extraction rate

當初始pH在4.4～5.4范圍時，菜籽餅多酚的提取率隨pH增加而緩慢增加，當pH為5.4時，多酚提取率最高（為2.65%），之后，多酚提取率隨著pH增加而下降，因此認為適宜的酶解pH為5.4。

2.1.1.4 溫度的選擇

溫度對菜籽餅多酚提取的影響見圖4。

圖4 溫度對多酚提取率的影響Fig.4 The influence of temprature on polyphenol extraction rate

當酶解溫度在30℃～55℃范圍時，菜籽餅多酚的提取率隨溫度增加而上升，當溫度為55℃時，多酚提取率最高（為2.71%），之后，隨著酶解溫度的繼續(xù)升高，多酚提取率反而下降，因此認為適宜的酶解溫度為55℃。在未達到酶的最適作用溫度前，升高溫度增加了包括酶和底物分子在內的溶液體系的熱能，既可使胞內活性物質分子運動速度加快，又能提供酶促反應所需的能量，使酶解破壁作用加強，故多酚提取率在開始階段迅速提高。但溫度繼續(xù)升高會生物酶部分甚至全部變性，抑制酶促反應，導致多酚提取率下降。2.1.1.5時間的選擇

時間對菜籽餅多酚提取的影響見圖5。

圖5 時間對多酚提取率的影響Fig.5 The influence of time on polyphenol extraction rate

當酶解時間在0.5 h～3.5 h時，菜籽餅多酚提取率隨反應時間延長而增加，反應時間為3.5 h時，多酚提取率最高（為2.78%），之后，多酚提取不再隨酶解時間延長升高，而是基本保持不變，因此認為適宜的酶解時間為3.5 h。一方面，隨著酶解時間的延長，植物細胞壁及細胞間層的纖維素和蛋白質形成的阻擋層已被有效破解，多酚大多已從細胞內擴散到溶液中，細胞內外的多酚濃度已達到了一種動態(tài)平衡，延長提取時間對提高溶液中多酚濃度作用有限；另一方面，纖維素酶和蛋白酶的酶促反應產物在溶液中濃度的積累會對酶促反應造成抑制；此外，菜籽餅中的某些酚類、單寧及花色素本來就是纖維素酶或蛋白酶的天然抑制劑，隨著酶解的進行，它們在溶液中的濃度增高也會抑制酶進一步地發(fā)揮作用。

2.1.2 正交試驗結果與分析

正交試驗結果見表2。

纖維素酶添加量、蛋白酶添加量、反應溫度和反應時間對多酚提取率有不同程度的影響，由極差分析得出RC>RD>RA=RB，說明各因素對多酚提取率影響的大小次順序為：反應溫度>反應時間>蛋白酶添加量=纖維素酶添加量，最顯著的影響因子為反應溫度。最佳的酶預處理工藝參數(shù)為A1B2C2D1，即纖維素酶添加量為1.4%，蛋白酶添加量為0.7%，反應溫度為50℃，反應時間為3 h。

2.1.3 最佳工藝的驗證

驗證性試驗發(fā)現(xiàn)多酚提取率平均值為3.12%，均高于單因素實驗和正交試驗結果，表明此工藝具有一定的合理性。

2.2 酶解法與非酶解法提取多酚的比較

分別取非酶解處理的樣品和經(jīng)最佳酶解工藝處理過的樣品各6個，采用湯務霞[11]的方法提取多酚。酶解法與非酶解法提取多酚的比較見圖6。

表2 正交試驗結果Table 2Results of orthogonal test

圖6 酶解法對多酚提取的影響Fig.6 Effect of Enzymolysis on polyphenol extraction

非酶解處理的菜籽餅經(jīng)乙醇浸提，大約50 min后多酚提取量率達到最大值，為2.02%；而經(jīng)最佳酶解工藝處理過的菜籽餅經(jīng)乙醇浸提，只需40 min即可獲得最大提取率，為3.12%，研究結果說明較之非酶解法，雙酶解法預處理可極大地提高菜籽餅多酚的提取率，提高了約54.46%。

3 小結

本實驗用纖維素酶和蛋白酶對菜籽餅進行復合預處理，然后采用乙醇浸提法提取菜籽餅多酚，研究雙酶法預處理對菜籽餅多酚提取率的影響。研究表明雙酶法預處理的最佳工藝條件為：纖維素酶添加量1.4%，蛋白酶添加量0.7%，反應溫度50℃，反應時間3h，酶解初始pH5.4，在此條件下多酚的得率為3.12%。研究還發(fā)現(xiàn)：較之非酶解法，雙酶解法預處理可極大地提高菜籽餅多酚的提取率，提高了約54.46%。

酶解輔助乙醇浸提法從菜籽餅中提取多酚不僅具有高效溫和、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點，而且多酚提取率比單純的乙醇浸提法高。本研究所建立的雙酶法輔助乙醇浸提法為菜籽餅多酚的提取提供了一種新工藝，同時也為去除菜籽餅中的抗營養(yǎng)因子、提高菜籽餅的綜合利用水平開辟了新途徑。

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The Effect of Double Enzymatic Pretreatment on Polyphenol Extraction from Rapeseed Cake

XIONG-Li，GU Liang-Fu
（Department of Biological Engineering，Sichuan University of Science and Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

In order to research the effect of enzymolysis on polyphenol extraction rate，polyphenol was extracted with ethanol after composite pretreatment of rapeseed cake with cellulase and protease.Results showed that the optimal condition of double enzymatic pretreatment was：cellulase add quantity 1.4%，proteinase 0.7%，reaction temperature 50℃，reaction time 3 h and initial pH5.4.On this condition，polyphenol extraction rate was 3.12%.Compared with non-enzymolysis，the double enzymolysis could increase polyphenol extraction rate by about 54.46%.

rapeseed cake；polyphenol；cellulase；protease；extract

2013-10-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.009

四川理工學院大學生創(chuàng)新基金（CX20130406）

熊俐（1976—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品科學。