張 宇， 郭冰玉， 回 薔， 全亮亮， 陶 凱

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實驗研究

氧化苦參堿增強多西他賽對黑色素瘤細胞增殖的抑制作用

張 宇， 郭冰玉， 回 薔， 全亮亮， 陶 凱

氧化苦參堿； 多西他賽； A375； 黑色素瘤

近年來皮膚腫瘤的發(fā)病率有所增加[1-2], 惡性黑色素瘤是死亡率最高的皮膚腫瘤[3-5]。因此，亟需尋找新的藥物來優(yōu)化化療方案，提高患者生存質量和生存期。氧化苦參堿可通過多種途徑抑制腫瘤細胞[6-7],多西他賽(Decetaxel)主要阻滯細胞周期的轉化[8]。目前尚無研究探討兩種藥物聯(lián)合用于黑色素瘤治療的效果。自2014-2015年，筆者觀察氧化苦參堿聯(lián)合多西他賽對細胞增殖的抑制效果，以及對細胞周期阻滯的影響，以期待改善化療藥物治療黑色素瘤的使用劑量，為優(yōu)化臨床治療黑色素瘤的方案提供理論基礎。

1 實驗材料

人黑色素瘤A375細胞株(購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所)，DMEM培養(yǎng)基(美國INVITROGEN公司)，胎牛血清(天津灝洋公司)，氧化苦參堿(美國SELLECK公司)，多西他賽注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT，美國SIGMA公司)，PI染料(上海碧云天生物技術有限公司)，Cyclin D1、CDK4、CDK6和GAPDH抗體(美國SANTA公司)，SYBR Green(美國PROMEGA公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(含50 IU/ml青霉素，50 IU/ml鏈霉素)培養(yǎng)A375細胞株，置37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將傳代的A375細胞分為4組：生理鹽水組、多西他賽組、氧化苦參堿組和兩種藥物聯(lián)合組。生理鹽水組為空白對照組。2.2 藥物處理濃度 多西他賽根據(jù)lin burg公式C=20D(C單位為μg/ml，D為臨床劑量單位為mg/kg·d-1)和體表面積計算公式S=1.15+(m-30)·0.1·5-1(其中m>30 kg)計算出所需藥物濃度。

2.3 MTT實驗 細胞培養(yǎng)12 h后，加入不同處理因素，各組3復孔。處理后細胞于不同時間點通過MTT方法記錄吸光值(490 nm)。藥物對細胞的抑制率計算公式為：

2.4 細胞周期分析 不同處理因素作用24 h后收集細胞，制成單細胞懸液。用70%的冰乙醇4 ℃固定1 h，用PI染液避光染色30 min，用流式細胞儀測定細胞周期。

2.5 WESTERN BLOT檢測蛋白表達水平 藥物作用24 h后收集細胞，提取蛋白后每個加樣孔上樣40 μg蛋白。進行SDS-PAGE電泳。2.6 PCR檢測蛋白RNA表達水平 TRIZOL法提取細胞總RNA，通過試劑盒反轉錄成cDNA，參照說明書進行REALTIME PCR反應。所用引物為Cyclin D1, F(5′-3′): CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGCT; R(5′-3′):GAAATCGTGCGGGGTCATTGCGGC; CDK4, F(5′-3′): CAGAGCTCTTAGCCGAGCGT;R (5′-3′): GGCACCGACACCAATTTCAG; CDK6, F(5′-3′): GTCTGATTACCTGCTCCGC; R(5′-3′): CCTCGAAGCGAAGTCCTC; GAPDH, F(5′-3′): CATCCCTTCTCCCCACACAC; R (5′-3′): AGTCCCAGGGCTTTGATTTG。

3 結果

表1所示，5 μg/ml多西他賽與10 μg/ml氧化苦參堿聯(lián)合應用對A375細胞增殖的抑制能夠起到協(xié)同作用的效果。各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);圖1所示，不同處理因素作用下，A375細胞的G1-S期轉化受到了不同程度的抑制，當多西他賽與氧化苦參堿聯(lián)合應用時，細胞周期G1-S期被阻滯的程度增強;圖2，3所示，當多西他賽與氧化苦參堿聯(lián)合應用時，蛋白被抑制的程度增強。

4 討論

黑色素瘤是皮膚腫瘤中最致命的一種腫瘤[9]，極具隱蔽性，術后化療是治療黑色素瘤的重要環(huán)節(jié)[10]。但由于化療藥物具有很強的毒副作用[11]。因此，尋找與化療藥物協(xié)同作用的藥物，對改善患者的生存質量具有積極意義。

表1 多西他賽、氧化苦參堿單獨使用以及聯(lián)合應用時細胞增殖的抑制作用

圖1 不同處理因素作用下細胞周期的變化 圖2 不同處理因素作用下A375細胞蛋白的變化 圖3 不同處理因素作用下A375細胞蛋白RNA水平的影響(*P<0.05，**P<0.01)

研究結果顯示，當?shù)蜐舛妊趸鄥A(10 μg/ml)與低濃度的多西他賽(0.1×PPC)聯(lián)合應用時，對A375細胞增殖的抑制起到了協(xié)同作用。流式分析技術也顯示聯(lián)合作用24 h時藥物對細胞周期G1～S期的阻滯作用增強。與此同時藥物聯(lián)用時對細胞周期相關蛋白的抑制作用顯著增強。由此可見，氧化苦參堿可以增強多西他賽對A375細胞增殖的抑制效果。研究表明，氧化苦參堿與抗腫瘤藥物聯(lián)合應用可產(chǎn)生協(xié)同作用。氧化苦參堿聯(lián)合環(huán)磷酰胺可增強其抗腫瘤效果[12]。氧化苦參堿也可以增強VCR、平陽霉素、順鉑和5-FU的化療效果[13]。與此同時氧化苦參堿與化療藥物聯(lián)合應用時也可提高化療耐受性和患者的生存質量[14-15]。

綜上所述，氧化苦參堿與多西他賽聯(lián)用可以降低多西他賽的使用濃度，避免了化療藥物高濃度引起的各種不良反應，改善患者生存質量。

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Enhancementofoxymatrineontheinhibitionofdocetaxelonmelanomaproliferation

ZHANGYu,GUOBing-yu,HUIQiang,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,TheGeneralHospitalofShenyangMilitary,Shenyang110840,China)

ObjectiveTo observe the enhancment of Oxymatrine on inhibition of Decetaxel on proliferation of human melanoma A375 cells.MethodsA375 cells were divided into four groups: saline group, Docetaxel treatment group, Oxymatrine treatment group and Docetaxel combined with Oxymatrine treatment group. The proliferation rate of A375 cells at different time points treated by different concentrations of drugs were tested by MTT and the cells cycle tested by flow cytometry. Then the protein level and RNA level of proteins were detected by western blot and realtime pcr.Results5 μg/ml of Docetaxel, 10 μg/ml of Oxymatrine or Oxymatrine combined with Docetaxel were treated on A375 cells, the inhibition of cell proliferation were (22.41±11.96)%, (12.96±4.33)% and (64.42±0.74)%. In control group and experience groups, the G1 phase of cell cycle were (68.09±6.75)%, (72.19±5.44)%, (76.65±1.88)% and (86.51±3.41)%. At the same time Oxymatrine could significantly enhance the inhibition of Cyclin D1, CDK4 and CDK6 by Decetaxel.ConclusionOxymatrine combined with Decetaxel having a synergistic effect on the inhibition of the proliferation of melanoma cells, which can decrease the side effects of Decetaxel.

Oxymatrine; Decetaxel; A375; Melanoma

】目的觀察氧化苦參堿對多西他賽抑制黑色素瘤細胞增殖的作用。方法將傳代的A375細胞分為4組：生理鹽水組、多西他賽組、氧化苦參堿組和兩種藥物聯(lián)合組，在不同的時間點通過MTT的方法檢測藥物對細胞增殖的作用；流式細胞儀檢測細胞周期；通過WESTERN BLOT以及PCR的手段檢測不同因素作用下相關蛋白的變化。結果對細胞作用24 h， 5 μg/ml多西他賽、10 μg/ml氧化苦參堿以及兩種藥物聯(lián)合處理組對A375細胞的增殖抑制率分別為(22.41±11.96)%、(12.96±4.33)%和(64.42±0.74)%。藥物聯(lián)合使用對A375細胞的抑制作用顯著高于各單藥組相同劑量藥物，各組間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。生理鹽水組以及不同藥物處理組細胞周期G1期的百分比分別為(68.09±6.75)%、(72.19±5.44)%、(76.65±1.88)%和(86.51±3.41)%。藥物聯(lián)用組對G1期阻滯作用增強。各組數(shù)據(jù)間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。氧化苦參堿也可增強多西他賽對蛋白Cyclin D1、CDK4和CDK6的抑制作用。結論氧化苦參堿(10 μg/ml)可顯著增強低濃度的多西他賽(0.01×PPC)對黑色素瘤細胞增殖的抑制作用，聯(lián)合應用能夠降低多西他賽的使用濃度，減少其引發(fā)的不良反應。

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.11.022

R739.5

A

1673-7040(2015)11-0702-03

2015-09-29)

110840 遼寧 沈陽，沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科

張 宇(1986-)，男，遼寧沈陽人，技師,碩士.

陶 凱，110840,沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 整形外科，電子信箱:plastypaper@163.com 【