呂雙陽，袁冬梅，許 潔，史亞利，肖 榕，呂朋沙，方志超，鄭小波

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮昌 402460）

睪丸間質(zhì)細(xì)胞（interstitialcell）又稱leydig cell，它是合成分泌雄性激素等物質(zhì)的內(nèi)分泌細(xì)胞，分布于睪丸生精小管間的疏松結(jié)締組織中[1]。睪丸間質(zhì)細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)功能，通過自分泌作用影響支持細(xì)胞從而間接作用于生殖細(xì)胞調(diào)節(jié)精子的生成[2]。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)和發(fā)揮多種生理功能。探討睪丸間質(zhì)細(xì)胞的作用，可以促進(jìn)對(duì)精子發(fā)生機(jī)制和雄性生殖生理功能的研究。

C-fos是一種核內(nèi)原癌基因，用免疫組織化學(xué)和原位雜交等方法發(fā)現(xiàn)在LC有原癌基因C-fos的表達(dá)[3]。許多研究已證實(shí)LC分泌睪酮伴有某些原癌基因表達(dá)的變化，特別是一些即早基因（如C-jun、C-fos等）表達(dá)的變化。況海斌，方立異等證實(shí)反義C-fos ASODNs能呈劑量相關(guān)方式抑制HCG誘導(dǎo)的大鼠間質(zhì)細(xì)胞睪酮的產(chǎn)生，而無義tat ODNs由于與C-fos無同源互補(bǔ)序列，未觀察到類似的作用[4]。Schultz等研究證實(shí)，C-fos參與調(diào)控生精上皮更新期間生精細(xì)胞增殖、分化活動(dòng)[5]。從文獻(xiàn)中可以看出，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者對(duì)C-fos的早期研究主要集中于體外培養(yǎng)的細(xì)胞，近年來轉(zhuǎn)向體內(nèi)，并且主要集中在人和鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的量和對(duì)睪酮合成途徑各關(guān)鍵酶的影響上，很少涉及到C-fos對(duì)豬及C-fos對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響。作者以榮昌仔豬為材料，通過反義核酸技術(shù)觀察C-fos對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響，為深入研究雄性睪酮分泌的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；胎牛血清（HyClone公司）；HCG、Ⅱ型膠原酶（Sigma公司）、仔豬睪酮ELISA檢測(cè)試劑盒（上海泛柯生化試劑公司）。C-fos ASODNs稀釋：稀釋前12000 r/min（4℃）離心5 min，使C-fos ASODNs聚集至管底，小心開啟管蓋，加入適量稀釋液，并蓋好管蓋，于漩渦混合器上使其充分溶解，稀釋濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L，分裝并-20℃保存。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康3周齡的榮昌公豬。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 C-fos ASODNs的合成 通過對(duì)榮昌仔豬C-fos基因序列的擴(kuò)增，選取高度親和力、基于mRNA高級(jí)結(jié)構(gòu)模擬、自由能計(jì)算合理、基因組中無同源性序列按要求設(shè)計(jì)C-fos ASODNs及無義核酸。然后由TaKaRa公司合成，分別對(duì)首位3個(gè)堿基進(jìn)行硫代磷酸化修飾。引物序列如下：

反義寡核苷酸：5′-CGGTGAGTGGTAGTAGGA GAGA-3′，無義核酸：5′-GTGTCGGTAGGACTGTG?GTATG-3′。

1.3.2 仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 無菌條件下采集3周齡的仔豬睪丸，放入冰浴的PBS中（PBS中抗生素濃度加倍），盡快送回實(shí)驗(yàn)室。首先用酒精棉球?qū)ΣG丸表面進(jìn)行消毒，并置于滅菌平皿中，然后用PBS和雙抗清洗睪丸，重復(fù)3次，用眼科剪、眼科鑷去除睪丸表面結(jié)締組織，剝?nèi)ケ荒ず颓誓?。再將睪丸移入另一個(gè)滅菌平皿中，用不完全培養(yǎng)基清洗3遍，并將睪丸組織剪碎至1 mm3的小塊，加入完全培養(yǎng)基，收集組織液，1000 r/min離心5 min，保留沉淀組織并重復(fù)3次，將沉淀組織移入燒杯中，加入5 mL不完全培養(yǎng)基和5 mL 0.5 mg/mL膠原酶消化液，37℃消化60 min，收集消化液，用適量完全培養(yǎng)基稀釋后并1000 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)2次，向沉淀中加入適量完全培養(yǎng)基，并用移液槍反復(fù)吹吸使之均勻散開，然后用200目銅網(wǎng)篩過濾得到單細(xì)胞懸液，通過臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞活力，3β-HSD酶活性檢測(cè)細(xì)胞純度。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果將間質(zhì)細(xì)胞稀釋至所需濃度，37℃，5%CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。

1.3.3 不同濃度C-fos ASODNs和無義tatODNs影響基礎(chǔ)狀態(tài)下間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成 按照1.3.2培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞。將試驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組，分別加入不同濃度的C-fos ASODNs，即0、0.125、0.25、0.5、1、2μmol/L，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。37℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液離心（1500 r/min離心5 min），收集培養(yǎng)液待測(cè)。無義tat ODNs作對(duì)照組，處理方法與試驗(yàn)組相同。

1.3.4 不同濃度C-fos ASODNs在HCG誘導(dǎo)下影響間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成 按照1.3.2培養(yǎng)間質(zhì)細(xì)胞。將試驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞分為6組，分別加入50 IU/mL的HCG以及不同濃度的C-fos ASODNs，即0、0.125、0.25、0.5、1、2 mol/L，每個(gè)處理設(shè)三個(gè)重復(fù)。37℃培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)液離心（1500 r/min離心5 min），收集培養(yǎng)液待測(cè)。對(duì)照組無義tat ODNs代替C-fos ASODNs，處理方法與試驗(yàn)組相同。

1.4 檢測(cè)方法 取出酶標(biāo)板，依照次序?qū)?yīng)分別加入50μL的標(biāo)準(zhǔn)品于空白微孔中；分別標(biāo)記樣品編號(hào)，加入50μL樣品于空白微孔中；在標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔中加入100μL的酶標(biāo)記溶液；37℃孵育反應(yīng)60 min；濃縮洗液與醫(yī)用蒸餾水1∶20倍稀釋后清洗酶標(biāo)板5次，每次靜置10 s～20 s；每孔加入底物A、B液各50μL；37℃下避光孵育反應(yīng)15 min；每孔加入50μL終止液，終止反應(yīng)。在波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上測(cè)定OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出睪酮濃度值（相關(guān)系數(shù)0.812）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel、SPSS11.5 For Win?dows等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間計(jì)量資料的比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能

2.1.1 臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞活性檢測(cè) 采用紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法計(jì)算無色透明的細(xì)胞數(shù)量，在倒置顯微鏡下觀察經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞懸液，活細(xì)胞呈無色透明，藍(lán)色為死細(xì)胞，其存活率為（91.0±4.6）%（n=5）。

2.1.2 3β-HSD細(xì)胞純度檢測(cè) 在倒置顯微鏡下觀察經(jīng)3β-HSD染色的細(xì)胞懸液，細(xì)胞質(zhì)中含有藍(lán)色顆粒細(xì)胞即為睪丸間質(zhì)細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞百分率為（84.9±3.5）%（n=5）。

2.2 不同濃度C-fos ASODNs和無義tat ODNs對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞（1×108細(xì)胞/mL）與不同濃度的C-fos ASODNs（0，0.125，0.25，0.5，1，2 μmol/L）在37 ℃條件下共同培養(yǎng)24 h。間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮隨著C-fos ASODNs濃度的增加而降低，兩者呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R=-0.611，P＜0.01）。在0.125μmol/L C-fos ASODNs時(shí)可顯著抑制睪酮產(chǎn)生（P＜0.01）。隨著C-fos ASODNs濃度增加對(duì)睪酮分泌抑制作用增加，呈計(jì)量依賴關(guān)系。而1μmol/L C-fos ASODNs以后的濃度，睪酮分泌處于相對(duì)穩(wěn)定水平，而無義tat ODNs無此關(guān)系（圖1）。

圖1 不同濃度C-fosA S O D Ns與基礎(chǔ)狀態(tài)下仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的關(guān)系

2.3 不同濃度C-fos ASODNs對(duì)HCG誘導(dǎo)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的影響 通過對(duì)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞（1×108細(xì)胞/mL）、50 IU/mL HCG和不同濃度的C-fos ASODNs（0，0.125，0.25，0.5，1，2 μmol/L）在37℃條件下共同培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示睪酮分泌隨著C-fos ASODNs濃度的增加而降低，兩者呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R=-0.776，P＜0.01），C-fos ASODNs濃度增加對(duì)睪酮分泌的抑制作用增強(qiáng)。在0.125μmol/L C-fos ASODNs時(shí)可顯著抑制睪酮產(chǎn)生（P＜0.01）。而無義tat ODNs無此關(guān)系（P＞0.05）（圖2）。

圖2 C-fosA S O D Ns和HCG誘導(dǎo)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的關(guān)系

3 討論

原癌基因(proto-oncogene)，又稱細(xì)胞癌基因，是廣泛存在于細(xì)胞基因組的正常成分，常與正常細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控直接相關(guān)。有資料表明，原癌基因參與性腺功能的調(diào)控[6]。c-fos原癌基因?qū)儆趍yc家族，在促進(jìn)性腺激素、生長(zhǎng)因子等方面有重要作用，能即刻、短暫表達(dá)，故被稱為即刻早期反應(yīng)基因[7]。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要功能是分泌睪酮，分泌活動(dòng)受丘腦下部、垂體及自身的調(diào)節(jié)。動(dòng)物體內(nèi)95%左右的睪酮是睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的。睪酮被運(yùn)輸?shù)缴眢w各處的靶器官，通過與受體結(jié)合發(fā)揮重要的生理功能[8]。有文獻(xiàn)表明，C-fos的表達(dá)能促進(jìn)小鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮。這種作用是C-fos表達(dá)后，其產(chǎn)物與AP-1位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)某些晚期基因轉(zhuǎn)錄，后經(jīng)過一系列酶的作用，促進(jìn)睪酮的合成和分泌[4]。在榮昌仔豬的睪酮分泌中，基礎(chǔ)狀態(tài)下間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮隨C-fos ASODNs濃度的增加而降低，而對(duì)照組的無義tat ODNs，睪酮的分泌量變化不大。這說明C-fos能促進(jìn)仔豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的生成，即C-fos ASODNs濃度增加，睪丸間質(zhì)細(xì)胞抑制增加，睪酮分泌下降。

近年來研究顯示，HCG引起睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的同時(shí)伴有C-fos原癌基因表達(dá)的增強(qiáng)[9]。當(dāng)HCG濃度為50 IU/mL時(shí)，大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的分泌最強(qiáng)，那么在HCG誘導(dǎo)的榮昌仔豬睪酮分泌中作用如何呢？本試驗(yàn)利用反義核酸技術(shù)，以目的基因C-fos序列為藍(lán)本，合成反義寡核苷酸與特定的C-fos基因序列形成特異性結(jié)合，抑制或封閉該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使其喪失功能，因而研究原癌基因C-fos對(duì)HCG誘導(dǎo)仔豬間質(zhì)細(xì)胞睪酮生成的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C-fos ASODNs呈劑量依賴性的抑制HCG誘導(dǎo)的仔豬間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌，在0.125μmol/L C-fos ASODNs時(shí)可顯著抑制睪酮產(chǎn)生，而無義tat ODNs無此關(guān)系。研究結(jié)果顯示，C-fos具有促進(jìn)HCG誘導(dǎo)的仔豬間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的作用。

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