王 彥，俞仲望，陳 思，李 玲，朱臻宇（第二軍醫(yī)大學(xué)，.藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室；.基礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室；.藥學(xué)院分析測(cè)試中心，上海200433）

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合代謝組學(xué)方法研究不同極化狀態(tài)下小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝差異

王 彥a，俞仲望b，陳 思a，李 玲c，朱臻宇c（第二軍醫(yī)大學(xué)，a.藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室；b.基礎(chǔ)部神經(jīng)生物教研室；c.藥學(xué)院分析測(cè)試中心，上海200433）

目的運(yùn)用代謝組學(xué)方法闡明經(jīng)典激活型（M 1型）、選擇活化型（M 2型）和靜息態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞的代謝差異。方法將體外培養(yǎng)小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞系（BV2）細(xì)胞，分為M 1組、M 2組和靜息態(tài)組，用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)特異性mRNA的表達(dá)差異以確定細(xì)胞極化狀態(tài)，采用基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法闡明代謝變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)M 1型與靜息態(tài)細(xì)胞的差異代謝物15個(gè)，M 2型與靜息態(tài)細(xì)胞的差異代謝物15個(gè)。結(jié)論通過代謝組學(xué)方法可以找到小膠質(zhì)細(xì)胞極化的差異代謝物，并解釋其可能的極化機(jī)制，為神經(jīng)退行性疾病的防治提供了理論依據(jù)。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；代謝組學(xué)；小膠質(zhì)細(xì)胞；實(shí)時(shí)定量PCR

小膠質(zhì)細(xì)胞是一種在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在的巨噬細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫防線。它分為兩種極化類型，即經(jīng)典激活型（M 1型）和選擇活化型（M 2型）。用脂多糖（LPS）和干擾素γ（IFN-γ）刺激，可以使細(xì)胞極化成為M 1型，用白介素4（IL-4）刺激可以使細(xì)胞極化成為M 2型。M 1型小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮促炎作用，具有分泌促炎因子、誘導(dǎo)NO合成、產(chǎn)生活性氧簇ROS、誘導(dǎo)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答、殺死微生物和抗腫瘤功能。M 2型是小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生免疫抑制的一種狀態(tài)，具有清除寄生蟲、抑制炎癥、促進(jìn)組織生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)等功能［1］。小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用［2］，最近的研究結(jié)果表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可以間接起到抗炎作用，而這些有益的小膠質(zhì)細(xì)胞往往呈現(xiàn)的是選擇活化型即M 2型［3］，而當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞被過度激活后則具有神經(jīng)毒性，丟失了有益的功能，轉(zhuǎn)而變成了促炎表型M 1型［4］。因此，研究小膠質(zhì)細(xì)胞的極化機(jī)制對(duì)防治神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。

細(xì)胞代謝組學(xué)是以細(xì)胞為研究對(duì)象，通過分析其在不同環(huán)境或刺激因子干預(yù)狀態(tài)下產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物來闡明可能的機(jī)制［5］。關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白組和基因組已有報(bào)道［6］，而本研究在代謝物水平，使用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法系統(tǒng)研究了M 1型、M 2型和靜息態(tài)BV2細(xì)胞間的代謝差異，推測(cè)BV2細(xì)胞極化的發(fā)生過程，進(jìn)一步完善對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 儀器 HA202M型天平（日本AND公司）；Trace U ltra／DSQⅡGC-MS型氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Thermo公司）；TR-5MS型石英毛細(xì)管柱（30 m× 0.25 mm，0.25μm，美國Thermo公司）；EDC-810型PCR儀（東勝創(chuàng)新公司）；Light Cycler96型RTPCR儀（瑞士Roche公司）。

1.1.2 試劑 甲氧胺鹽酸鹽、N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺（MSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS）、吡啶（Sigma公司）；正庚烷、甲醇、氯仿和氯化鈉（分析純，國藥集團(tuán)）；柱式Trizol總RNA抽提試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、熱啟動(dòng)SYBR Green染料試劑盒（生工生物公司）；引物由上海英駿公司合成。

1.1.3 細(xì)胞株與培養(yǎng)液 BV2細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）；胎牛血清、DMEM F12培養(yǎng)液、雙抗、磷酸緩沖液和胰酶（Gibco公司）；鼠IL-4、鼠INF-γ及LPS（R＆D公司）；10 cm培養(yǎng)皿和六孔板（Corning公司）。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青／鏈霉素雙抗的DMEM F12（Gibco）在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85%時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為3組：靜息態(tài)組（C）、M 1組（M 1）、M 2組（M 2），每組5皿。細(xì)胞用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，M 1組加入LPS和INF-γ刺激，M 2組加入IL-4刺激，24 h后將全部培養(yǎng)皿取出。其中LPS的終濃度為100 ng／m l，INF-γ的終濃度為100 ng／m l，IL-4的終濃度為10 ng／m l。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR） 將BV2細(xì)胞種于六孔板中，每孔106個(gè)細(xì)胞，用柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取3組細(xì)胞的總RNA。使用第一鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA，使用熱啟動(dòng)SYBR Green染料試劑盒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。每組反應(yīng)做3個(gè)復(fù)孔，各組分別是精氨酸酶1（A rg-1）、白介素-1β（IL-1β）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、巨噬細(xì)胞甘露糖受體-1（MRC-1）以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。這些特異性基因的上下游引物序列從Eurogentec網(wǎng)站獲取。

1.2.3 細(xì)胞樣品制備 棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用生理鹽水洗滌2次，加入1m l－20℃70%甲醇猝滅。小心用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，移至事先干燥稱重的1.5 m l離心管中。將其在氮?dú)庀麓蹈?，再次稱重得細(xì)胞干重。在離心管中加入1.8 m l氯仿-甲醇-水（2∶5∶2）的乳濁液，冰水混合物中超聲30 min后8 455 r／m in離心10 min，取上清液，氮?dú)庀麓蹈珊筮M(jìn)行衍生化處理。衍生化過程中為每管加入15 mg／m l甲氧胺吡啶37.5μl，渦旋1min后，70℃烘箱烘干，1 h后，加入37.5μl含1%TMCS的MSTFA，渦旋1 m in，室溫下放置1 h，溶于100μl正庚烷，渦旋1 min后，6 684 r／min離心5 m in，吸取100μl上清液至進(jìn)樣小瓶，用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS條件 進(jìn)樣量為1μl；進(jìn)樣口溫度：250℃；升溫程序：起始溫度為70℃，保持4 min，4℃／min升至220℃，后以8℃／min升至300℃，保持10 min。圖譜從第3分鐘開始采集，共采集60 min。載氣：高純氮?dú)?；流?.0 m l／min；分流模式：10∶1。

質(zhì)譜條件的選擇：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：250℃；接口溫度：260℃；電子能量：70 eV；調(diào)諧方式：標(biāo)準(zhǔn)調(diào)諧；質(zhì)譜掃描方式：全部掃描；范圍：15～800 amu；掃描速度：5 s／dec。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 GC-MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)Thermo Xconvert軟件轉(zhuǎn)換為NetCDF格式，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)經(jīng)XCMS軟件進(jìn)行峰校正和峰積分，產(chǎn)生一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)核比、峰強(qiáng)度的三維矩陣后，采用MATLAB 7.0對(duì)離子峰進(jìn)行過濾，僅保留相同保留時(shí)間下豐度最大的離子峰，除以每個(gè)樣品的細(xì)胞干重值進(jìn)行歸一化，得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P V11.0軟件經(jīng)過中心化和帕累托變換預(yù)處理，標(biāo)準(zhǔn)化后用偏最小二乘法判別分析（PLS-DA），選取VIP值（variable influence in the projection）＞1作為潛在標(biāo)記物，求出每個(gè)差異代謝物的RSD值，剔除＞30%的數(shù)據(jù)后，與X-caliber自帶的NIST庫進(jìn)行匹配得到最后的差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1RT-PCR 各組BV2細(xì)胞提取總mRNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用qRT-PCR檢測(cè)IL-1β、iNOS、TNF-α、A rg-1和MRC-1的表達(dá)情況，如圖1所示。用LPS和鼠INF-γ刺激后可以升高iNOS、TNF-α的水平，分別為靜息態(tài)組的2.82倍和3.13倍，并使A rg-1的表達(dá)量顯著下降，為靜息態(tài)組的0.122倍。用鼠IL-4處理BV2細(xì)胞24 h后使A rg-1、MRC-1水平升高，為靜息態(tài)組的26.5倍和2.63倍，而IL-1β和TNF-α水平則明顯下降，為靜息態(tài)組的0.611倍和0.161倍，說明BV2細(xì)胞極化成功。

圖1 qRT-PCR顯示3種狀態(tài)下BV2細(xì)胞特異性表達(dá)mRNA情況

2.2不同狀態(tài)BV2細(xì)胞裂解液GC-MS總離子流圖 M 1、M 2和靜息態(tài)BV2細(xì)胞經(jīng)過提取后將胞內(nèi)代謝物進(jìn)行衍生化處理，分析得到GC-MS總離子流圖，其典型圖譜如圖2所示。

圖2 靜息態(tài)（A）、M 1型（B）、M 2型（C）BV2細(xì)胞裂解液GC-MS總離子流圖

2.3標(biāo)志物的尋找 通過XCMS軟件進(jìn)行峰校正和峰積分后，得到1 058個(gè)離子峰，通過非靶標(biāo)離子篩選，去除同一內(nèi)源性代謝物的碎片衍生物，簡(jiǎn)化得到159個(gè)離子峰。本研究中，我們構(gòu)建了PLS-DA模型，分析比較M 1和靜息態(tài)、M 2和靜息態(tài)細(xì)胞裂解液的關(guān)系，該得分圖的分離趨勢(shì)用R2和Q2表示（R2X＝0.712，R2Y＝0.992，Q2Y＝0.939），R2X、R2Y和Q2Y是PLS-DA模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)。R2X表示計(jì)算所得隱變量反映自變量X的變異程度，R2Y用來表示隱變量反映因變量Y的變異百分比，Q2Y為交叉驗(yàn)證后PLS-DA模型能夠預(yù)測(cè)X和Y變異的能力，它們的值應(yīng)盡可能接近1，如圖3所示。為了找到可以區(qū)分組間關(guān)系的離子峰，我們進(jìn)一步使用PLS-DA，篩選VIP值大于1的峰作為潛在差異代謝物，如圖4所示，對(duì)照NIST庫，挑選相似度80%以上，RSD值小于30%的值。最終得到M 1和靜息態(tài)的差異代謝物共15個(gè)，涉及9個(gè)代謝通路，其中D-葡萄糖、葡萄糖醇、乳酸、果糖、蔗糖、焦谷氨酸、甘氨酸、檸檬酸、磷酸、腐肉堿、阿糖醇較靜息態(tài)升高，硬脂酸、油酸、甾鏈醇、十六烯酸較靜息態(tài)降低；M 2和靜息態(tài)的差異代謝物15個(gè)，也涉及9個(gè)代謝通路，其中鳥氨酸、甘氨酸、丙氨酸、氨基丙酸、谷氨酸、天冬酰胺、琥珀酸、蘇氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、腐肉堿、乙醇胺、肌醇、阿糖醇、肉豆蔻酸較靜息態(tài)升高，如表1、表2所示。

圖3 由BV2細(xì)胞胞內(nèi)代謝物GC-MS圖譜獲得的PLS-DA得分圖

圖4 BV2細(xì)胞得分載荷圖

表1 GC-MS法測(cè)得M1與靜息態(tài)BV2細(xì)胞差異代謝物的特征

表2 GC-MS法測(cè)得M 2與靜息態(tài)BV2細(xì)胞差異代謝物的特征

3 討論

3.1糖代謝 從結(jié)果可見M 1型細(xì)胞的D-葡萄糖、葡萄糖醇、乳酸、果糖、蔗糖及磷酸成分較靜息態(tài)高，而M 2型細(xì)胞的糖類成分沒有太多變化［1］。M 1型細(xì)胞的無氧酵解增強(qiáng)，而M 2型的無氧酵解沒有顯著增強(qiáng)，M 1型BV2細(xì)胞能夠打開6-磷酸果糖激酶開關(guān)，使果糖濃度升高。M 1型細(xì)胞的殺菌力增強(qiáng)，而類似于糖酵解的無氧過程最符合此情況下升高能量的要求。另外，結(jié)果中檸檬酸成分升高，與Halabe［7］的研究結(jié)果相符，即檸檬酸作為三羧酸循環(huán)中的產(chǎn)物對(duì)糖酵解有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用。相反的，在M 2型細(xì)胞中存在葡萄糖代謝，能夠?yàn)樾迯?fù)組織提供持續(xù)的能量。另據(jù)Glanzer等［6］的蛋白組學(xué)研究結(jié)果，激活后的BV2細(xì)胞中β-葡萄糖苷酶的表達(dá)量上調(diào)，該酶可以將細(xì)胞中低分子纖維糊精及一些纖維二糖、三糖分子中結(jié)合于末端的葡萄糖鍵打開，同時(shí)釋放出葡萄糖，這與本研究結(jié)果中M 1型的葡萄糖成分上調(diào)相符合。

3.2脂質(zhì)代謝 脂質(zhì)代謝能夠提供細(xì)胞發(fā)生吞噬作用時(shí)的能量需求，并在細(xì)胞膜流動(dòng)中起到重要作用。M 1型細(xì)胞中的COX-2酶上調(diào)，而COX-1酶下降，M 2型細(xì)胞則反之。BV2細(xì)胞可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝來應(yīng)對(duì)所發(fā)生的炎癥反應(yīng)。本研究中M 2型細(xì)胞代謝物的脂肪酸成分明顯上調(diào)，而M 1型的則下降，與Odegaard等［8］的研究結(jié)果相符。同時(shí)，根據(jù)Glanzer等的研究結(jié)果，經(jīng)過視神經(jīng)及坐骨神經(jīng)碎片刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞，其脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP-3）、載脂蛋白E（apoE）表達(dá)量上調(diào)，F(xiàn)ABP-3是一種細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)結(jié)合超家族成員，而apoE是低密度脂蛋白膽固醇的配體，它們能夠調(diào)控各種生化代謝特別是脂質(zhì)代謝，其含量的升高可能與M 2型吞噬能力增強(qiáng)相關(guān)，也與本研究中M 2型細(xì)胞中脂肪酸代謝物含量升高的結(jié)果相符合。

3.3氨基酸代謝 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M 1型細(xì)胞裂解液中焦谷氨酸、甘氨酸成分明顯升高，M 2型細(xì)胞中鳥氨酸、琥珀酸、甘氨酸、丙氨酸、氨基丙酸、谷氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺成分明顯升高。

M 2型細(xì)胞中的A rg-1表達(dá)量升高，A rg-1能將精氨酸轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素，因此在M 2型細(xì)胞裂解物中可見鳥氨酸成分明顯增多，這與Van Gool等［9］的結(jié)論相符。由于鳥氨酸在尿素循環(huán)中存在，因此可見其下游的琥珀酸含量也升高。精氨酸酶在細(xì)胞增殖、組織修復(fù)和膠原合成中起到重要作用。與該代謝相關(guān)的半胱氨酸和酪氨酸代謝也與免疫抑制相關(guān)。根據(jù)文獻(xiàn)［6］，M 2型細(xì)胞中的天冬酰胺基葡萄糖酶含量較靜息態(tài)減少，該酶可以將天冬酰胺水解成天冬氨酸，酶的含量減少會(huì)導(dǎo)致天冬酰胺的蓄積，這與本研究的結(jié)果相符合。

3.4腐胺 腐胺的含量在M 1型中有所升高，因?yàn)楦吩谥舅岷铣杉把趸衅鸬街匾饔?，Di Marzio等［10］的研究顯示腐肉堿可能具有抑制酸性脂肪酸合成的功能。腐胺在M 2型中升高可能是因?yàn)镸 2型中鳥氨酸含量升高并在鳥氨酸脫羧酶催化下脫去羧基得到腐胺，所以其含量也明顯升高。

3.5檸檬酸 檸檬酸循環(huán)是有氧代謝的中心，可促進(jìn)合成糖、脂肪、氨基酸等物質(zhì)的底物。本研究中，M 1型細(xì)胞代謝物的檸檬酸含量明顯升高，而M 2型中處于檸檬酸循環(huán)中的琥珀酸含量升高。這一結(jié)果可以推測(cè)出葡萄糖作為底物的利用率的升高導(dǎo)致了檸檬酸循環(huán)的升高。

本研究首次使用基于GC-MS的代謝組學(xué)方法結(jié)合qRT-PCR指標(biāo)研究小膠質(zhì)細(xì)胞的極化機(jī)制，從中找到共26種差異代謝物，預(yù)測(cè)并分析了其可能的代謝通路。M 1型和M 2型小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)影響神經(jīng)退行性疾病的進(jìn)程具有重要作用，因此該研究對(duì)闡明尚不清楚的神經(jīng)退行性疾病機(jī)制具有潛在意義，同時(shí)也為該病的防治提供了新的思路。

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Comparative analysis of different states of polarized BV 2 cells by GC-MS combined withmetabonom ic technology

WANG Yana，YU Zhongwangb，CHEN Sia，LILingc，ZHU Zhenyuc（Second M ilitary Medical University，a.Department of Pharmaceutical Analysis，School of Pharmacy；b.Institute of Neuroscience and Key Laboratory of Molecular Neurobiology of the M inistry of Education，College of Basic Medical Science；c.Pharmaceutical Analysis Center，Schoolof Pharmacy，Shanghai200433，China）

ObjectiveTo analyze the differentmetabolites of the classical activated（M 1），alternatively activated（M 2）and resting BV2 cells by metabolomicsmethod.MethodsThemRNAs of several potential biomarkers were determined by real-time PCR analyses to confirm the state of BV 2 cells.Static GC-MS combined w ith metabolom ics technology was used to analyze themetabolic changes.ResultsTherewere 15 biomarkers identified between the M 1 group and the resting group，and 15 biomarkerswere found in the M 2 group and the resting group.ConclusionThe present study provides an effectiveway to reveal themechanism of the polarization of BV 2 cell，and itm ight provide a theoreticalbasis to preventor treat the neurodegenerative diseases.

GC-MS；metabonomic；m icroglia cell；RT-PCR

R917

］ A

1006-0111（2015）03-0226-05

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.03.009

2014-12-02

2015-03-17

［本文編輯］ 顧文華

國家自然科學(xué)基金（81273474，31100765）

王 彥，碩士研究生.E-mail：wangyan.sophia＠163.com

朱臻宇，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師.研究方向：代謝組學(xué).Tel：（021）81871261；E-mail：zzyzyfzhu＠163.com