王瑞雨，張 靖，朱麗媛，彭小忠,2*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005)

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基因間長(zhǎng)非編碼RNA: T-UCRs轉(zhuǎn)錄活性的驗(yàn)證

王瑞雨1，張 靖1，朱麗媛1，彭小忠1,2*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005)

目的選擇小鼠大腦皮層胚胎發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄的一類非編碼RNA，即基因間區(qū)的T-UCRs作為研究對(duì)象，探究小鼠基因組上基因間超保守區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性。方法1)利用UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI37/mm9)通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)篩選在小鼠14.5 d胎腦中可能表達(dá)的基因間UCR；2)Coding Potential Assessment Tool(CPAT)和Coding Potential Caculator(CPC)對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行編碼能力預(yù)測(cè)；3)RT-PCR對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；4)Real-time PCR分析T-uc.62在不同組織中的表達(dá)差異以及在小鼠不同發(fā)育階段腦組織中的表達(dá)變化。結(jié)果1)通過UCSC網(wǎng)站上的RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到16個(gè)可能在小鼠E14.5腦組織中表達(dá)的基因間UCRs；2)通過CPAT和CPC分析，16個(gè)UCRs均不具有蛋白編碼能力，提示可能是非編碼RNA；3)經(jīng)過RT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)有15個(gè)是可以表達(dá)的；4)以T-uc.62為例，其主要在小鼠發(fā)育階段的腦組織中高表達(dá)，而在小鼠的成年組織中低表達(dá)甚至不表達(dá)。結(jié)論基因間超保守區(qū)域可以轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)非編碼RNA，其中，T-uc.62主要在小鼠發(fā)育階段的腦組織中高表達(dá)；其可能在大腦發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。

UCR；小鼠大腦發(fā)育；T-uc.62

哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育一直是神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，其具有嚴(yán)格的時(shí)空特異性，這種時(shí)空特異性受到多種非編碼RNA的調(diào)控[1- 2]。有一類長(zhǎng)非編碼RNA是由超保守區(qū)域(ultra-conserved regions,UCRs)轉(zhuǎn)錄生成的，稱為超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄本(transcribed ultra-conserved regions, T-UCR)。目前關(guān)于T-UCR的研究?jī)H限于腫瘤組織中[3- 4]，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的研究尚未見報(bào)道。UCRs多位于重要調(diào)控部位，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和發(fā)育過程；基因間區(qū)的UCRs多位于轉(zhuǎn)錄和發(fā)育相關(guān)基因的附近[5]。因此，本研究以基因間區(qū)可能轉(zhuǎn)錄的UCRs為研究對(duì)象，通過生物信息學(xué)分析及RT-PCR等實(shí)驗(yàn)方法尋找小鼠大腦發(fā)育階段可能表達(dá)的基因間T-UCR，并考察這類長(zhǎng)非編碼是否具有轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特異性，以期為后續(xù)研究這一類非編碼RNA的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)ICR品系小鼠： 8～10周齡 (26～30 g)，孕鼠與 E10.5、E12.5、E14.5、E16.5和E18.5的胎鼠以及P1、P3、P7、P14和P21的幼鼠 [北京維通利華公司，合格證號(hào)：SCXK (京) 2012-0001]于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心培養(yǎng)。

1.1.2 試劑: Trizol(Invitrogen公司)、RNase抑制劑、RNase-Free DNaseI和SYBR green Mix(TaKaRa公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Transgen公司)、Taq DNA聚合酶(北京天根公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析: 利用Mestdagh等[6]2010年在Oncogene發(fā)表文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)庫(kù)分析整理出186個(gè)基因間UCR的序列信息，將186個(gè)序列信息逐一輸入到UCSC Genome Browser on Mouse July 2007 (NCBI37/mm9) Assembly網(wǎng)站(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)上，經(jīng)過BLAT和Browser后，獲取在Whole Brain Embryonic day 14.5 RNA-seq Signal from ENCODE/LICR 通道中有表達(dá)信號(hào)的T-UCRs。

通過兩種生物學(xué)軟件Coding Potential Assessment Tool[7](CPAT, http://lilab.research.bcm.edu/cpat/)和Coding Potential Caculator[8](CPC, http://cpc.cbi.pku.edu.cn/programs/run_cpc.jsp)在線預(yù)測(cè)篩選到的16個(gè)可能在小鼠胚胎腦組織中表達(dá)的T-UCR的編碼能力。

1.2.2 RNA的提取及real-time PCR: 取新鮮鼠腦組織，立即液氮中凍存，稱取組織重量，按照20 mg/mL Trizol的比例進(jìn)行消化，勻漿器勻漿后釋放RNA，氯仿-異丙醇抽提，75% DEPC-乙醇漂洗后，空氣干燥，加入適量DEPC處理過的水溶解。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量后，用RNase Free DNase I對(duì)提取的RNA進(jìn)行消化DNA處理，使用比例為RNA 10 mg/mL RNase Free DNase I，37 ℃水浴20 min，然后異丙醇沉淀，純化RNA樣品。普通PCR鑒定RNA中DNA除凈后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將2 μg的RNA使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄成20 μL體系的cDNA。使用小鼠E14.5全腦cDNA進(jìn)行RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證；各基因均使用1 μL的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，使用引物及擴(kuò)增長(zhǎng)度(表1)，在CFX- 96儀器(Bio-Rad公司)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件為：95 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、57～58 ℃ 30 s， 循環(huán)45次，并作熔解曲線。使用Gapdh為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法，重復(fù)樣本(n=3)。

1.2.3 引物設(shè)計(jì): 本實(shí)驗(yàn)中所用引物均是使用DNAMAN7.0進(jìn)行設(shè)計(jì)后NCBI進(jìn)行比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 UCSC RNA-seq數(shù)據(jù)庫(kù)表達(dá)能力預(yù)測(cè)

篩選到16個(gè)有表達(dá)信號(hào)的UCRs，初步認(rèn)為這些UCRs是可以被轉(zhuǎn)錄出來的(表2)。

2.2 編碼能力預(yù)測(cè)

16個(gè)UCRs的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均不具備編碼能力(表3)。

表1 實(shí)驗(yàn)中所使用的引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 The sequences of RT-PCR and real-time PCR primers in this study

*F=forward, R=reverse, M=mouse, H=human

表2 小鼠胚胎期14.5天腦組織中表達(dá)的基因間T-UCRs

表3 16個(gè)基因間T-UCRs的編碼能力預(yù)測(cè)

*CPC score:<0 noncoding RNA；0～1 weakly coding RNA；>1 protein coding RNA.

2.3 RT-PCR表達(dá)驗(yàn)證

上述16個(gè)備選UCRs有15個(gè)在小鼠14.5天胎腦組織中具有轉(zhuǎn)錄能力，uc.284除外(圖1)。

圖1 16個(gè)基因間UCRs在小鼠E14.5全腦的表達(dá)Fig 1 Expression of 16 intergenic UCRs in mouse E14.5 Brain

2.4 T-uc.62在小鼠不同組織中的表達(dá)情況

除脾臟外，T-uc.62在其他成年組織中的表達(dá)量相對(duì)于14.5天胎腦組織的表達(dá)量幾乎為零(圖2)。

圖2 T-uc.62在小鼠不同組織中的表達(dá)Fig 2 Expression of T-uc.62 in different mouse tissues

2.5T-uc.62在小鼠腦組織發(fā)育的不同階段的表達(dá)

T-uc.62在胚胎時(shí)期及幼年早期的表達(dá)量比較高；隨時(shí)間推移，其表達(dá)量逐漸降低，在成年時(shí)維持在一定的水平(圖3)。

圖3 T-uc.62在小鼠發(fā)育不同階段腦組織中的表達(dá)Fig 3 Expression of T-uc.62 at different develop-mental stages of mouse brain

3 討論

超保守區(qū)域是指在人、小鼠和大鼠的基因組上完全保守的區(qū)域，無任何堿基的缺失、插入或者突變。UCRs的長(zhǎng)度范圍為200～779 bp，共有481個(gè)[5]。根據(jù)UCRs與基因的位置關(guān)系，將其分為5類：包含外顯子的(exon containing)、外顯子內(nèi)的(exonic)、包含部分外顯子的(partly exonic)、基因間的(intergenic)和內(nèi)含子區(qū)的(intronic)[6]。基因間的超保守區(qū)域在物種進(jìn)化過程中被完整的保存下來，大多出現(xiàn)在調(diào)控轉(zhuǎn)錄和發(fā)育相關(guān)基因的附近，它們的存在或許不是偶然的，可能轉(zhuǎn)錄生成某些非編碼RNA。本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)以及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有15個(gè)基因間的UCRs在小鼠胚胎腦組織中可以轉(zhuǎn)錄生成長(zhǎng)非編碼RNA T-UCRs，說明基因間的超保守區(qū)域確實(shí)具有轉(zhuǎn)錄的能力。

有研究者對(duì)8個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA表達(dá)芯片進(jìn)行了組織特異性分析，共涵蓋了12 115個(gè)非編碼RNA和6 856個(gè)編碼基因[9]，結(jié)果顯示，編碼基因多呈現(xiàn)廣泛性表達(dá)，然而內(nèi)含子長(zhǎng)非編碼RNA、反義長(zhǎng)非編碼RNA和基因間的長(zhǎng)非編碼RNA往往呈現(xiàn)組織特異性表達(dá)，尤其是基因間的長(zhǎng)非編碼RNA以腦組織特異性表達(dá)最顯著。本研究中，通過對(duì)T-uc.62在小鼠不同成年組織、腦發(fā)育不同時(shí)間點(diǎn)中的表達(dá)譜分析顯示，T-uc.62在腦組織中的表達(dá)量高于其他組織，且在小鼠胚胎期腦組織中的表達(dá)量高于成年組織，說明T-uc.62在小鼠胚胎腦組織中特異性表達(dá)，這一結(jié)果為T-uc.62在小鼠腦胚胎發(fā)育階段可能發(fā)揮功能的探索提供了初步證據(jù)。

研究發(fā)現(xiàn)，T-UCRs在多種腫瘤組織中具有重要的調(diào)控作用。例如， T-uc.300+A對(duì)全反式維甲酸誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-BE和SH-SY5Y的增殖和侵襲具有促進(jìn)作用[10]。再比如，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116 細(xì)胞中，uc.283+A(T-uc.283+A)在pri-miR- 195的Drosha剪切位點(diǎn)上可以與Drosha剪切酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合pri-miR- 195，通過占位作用阻礙Drosha剪切酶對(duì)pri-miR- 195的剪切作用，從而使成熟miR- 195生成減少[11]。T-UCRs在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用正在逐步被揭示出來，說明T-UCRs的功能和機(jī)制研究已經(jīng)起步，相信T-UCRs在生命體的發(fā)育過程中的功能與作用也將會(huì)被一一呈現(xiàn)。

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新聞點(diǎn)擊

活動(dòng)與支架舒緩關(guān)節(jié)炎疼痛

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)2013-11-06報(bào)道，研究指出，骨關(guān)節(jié)炎會(huì)痛，但運(yùn)動(dòng)能改善患者或高風(fēng)險(xiǎn)族群的生活質(zhì)量。另一篇研究指出，膝關(guān)節(jié)炎患者可以用簡(jiǎn)單的支架舒緩疼痛。

骨關(guān)節(jié)炎或磨損性關(guān)節(jié)炎與老化有關(guān)，是最常見的關(guān)節(jié)炎，癥狀包括關(guān)節(jié)疼痛與僵硬。膝關(guān)節(jié)炎是漸進(jìn)式的關(guān)節(jié)軟骨受損，所謂關(guān)節(jié)軟骨是指長(zhǎng)骨尾端的緩沖物，這種傷害會(huì)導(dǎo)致肌肉萎縮、疼痛以及腫大。

芝加哥西北大學(xué)的研究人員Kai Sun醫(yī)生表示，即使是少量運(yùn)動(dòng)也有幫助。運(yùn)動(dòng)越多，整體生活質(zhì)量越好。

膝蓋有穿戴支架的患者表示，6周后減少約40%的疼痛。研究人員建議，可以用軟的尼奧普林支架(Neoprene-like)。另外，專家們建議，患者可做有氧運(yùn)動(dòng)以及重量訓(xùn)練，那些不曾運(yùn)動(dòng)的人可以從每周運(yùn)動(dòng)3次、每次15 min開始。

Validation of intergenic long non-coding RNA: T-UCRs for their transcriptional activities

WANG Rui-yu1, ZHANG Jing1, ZHU Li-yuan1, PENG Xiao-zhong1,2*

(1.State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Dept. of Molecular Biology and Biochemistry, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS; 2.Neuroscience Center, CAMS, Beijing 100005，China)

ObjectiveExploration of the embryonic development related transcriptional activities of a specific class of lncRNA, T-UCR (transcribed ultra-conserved regions) in the brain.MethodsUCSC Genome Browser(NCBI37/mm9) RNA-seq, Coding Potential Assessment Tool (CPAT) and Coding Potential Calculator (CPC), RT-PCR and real-time PCR were employed to identify T-UCR, to predict coding potential, to display the spatio-temporal patterns in different mouse adult tissues and different mouse development stages of embryonic brain, respectively.ResultsThere are 15 intergenic T-UCRs expressed in mouse embryonic brains, which may function as long noncoding RNAs. T-uc.62 is prominently expressed in mouse embryonic brains, rather than other adult tissues.ConclusionsThe intergenic T-UCR can be transcribed to long noncoding RNAs, and T-uc.62 is expressed mainly

UCR; mouse brain development; T-uc.62

2015- 01- 23

：2015- 03- 13

國(guó)家自然科學(xué)基金(31370789)

*通信作者(correspondingauthor)：pengxiaozhong@pumc.edu.cn

1001-6325(2015)05-0632-05

研究論文

Q522

：A

in mouse embryonic brains, which infers that T-uc.62 may be important in brain development.