毛曉晶，曾 洋，韓 欽*，趙春華*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 組織工程中心， 北京 100005；2.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程， 北京 100084)

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明膠微冰膠支架有利于脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外干性維持并提高其體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值

毛曉晶1，曾 洋2，韓 欽1*，趙春華1*

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 組織工程中心， 北京 100005；2.清華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程， 北京 100084)

目的研究人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)與明膠微冰膠材料體外聯(lián)合培養(yǎng)時(shí)，材料是否能維持間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。方法ADSCs種植于明膠微冰膠材料后進(jìn)行Calcein-AM和PI活細(xì)胞染色檢測細(xì)胞活力，細(xì)胞滴度藍(lán)法檢測細(xì)胞增殖能力，定量PCR檢測干性基因OCT4、Nanog、SOX2表達(dá)情況，以及在成脂成骨誘導(dǎo)過程比較ADSCs在二維環(huán)境和種植于明膠微冰膠材料后的分化潛能。結(jié)果ADSCs在三維明膠微冰膠支架材料中能保持較高活性，增殖能力不受影響，干性基因表達(dá)上調(diào)，成脂成骨分化相關(guān)基因表達(dá)水平比二維誘導(dǎo)環(huán)境低。結(jié)論明膠微冰膠可以為ADSCs提供一個(gè)較二維培養(yǎng)更好的微環(huán)境，有利于ADSCs體外干性維持，從而在干細(xì)胞移植法治療相關(guān)疾病時(shí)以非侵入性的細(xì)胞傳遞方式發(fā)揮更長期的應(yīng)用價(jià)值。

人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；明膠微冰膠

成體干細(xì)胞中人脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells from adipose tissue,hADSCs)迄今已廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床前期研究中。ADSCs具有三方面優(yōu)勢：一是具有自我更新能力和三胚層分化潛能，如分化成脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、神經(jīng)元、肝臟細(xì)胞等；二是來源豐富，取材方便，可以大量獲取種子細(xì)胞；三是具有免疫調(diào)節(jié)功能，能降低炎性反應(yīng)和移植排斥反應(yīng)發(fā)生率[1]。ADSCs在正常機(jī)體可以一生維持未分化狀態(tài)，但是在體外培養(yǎng)瓶或皿中時(shí)，會(huì)經(jīng)歷老化過程，增殖能力減弱[2]。因此間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在不確定的體內(nèi)外環(huán)境中干性狀態(tài)能否維持是長期臨床應(yīng)用主要考慮的問題[3]。

生物學(xué)支架材料，如膠原、明膠、纖連蛋白和透明質(zhì)酸，可用于體外培養(yǎng)ADSCs。明膠是膠原蛋白水解后產(chǎn)物，是一種無味、半透明、堅(jiān)硬的薄片、顆?；蚍勰钗镔|(zhì)，廣泛應(yīng)用于組織工程中。本研究中使用的明膠微冰膠(gelatin microcryogels)在以前的研究中曾應(yīng)用于小鼠下肢缺血模型。細(xì)胞在明膠微冰膠中用常規(guī)胰蛋白酶消化法能夠傳代生長，二者存在相互作用，本研究將進(jìn)一步探索在體外培養(yǎng)環(huán)境中，生物可降解性的明膠微冰膠三維支架材料如何影響ADSCs增殖分化潛能和干性狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 試劑

人無菌脂肪組織(西宮整形美容機(jī)構(gòu)，遵循知情同意原則)；明膠(Sigma-Aldrich公司)；Cell Titer-Blue? Cell Viability Assay(Promega公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR定量PCR試劑盒(Takara公司)；油紅O、茜素紅(Sigma公司)；堿性磷酸酶染色試劑盒(天津血液研究所)。

1.2 ADSCs和明膠微冰膠體外聯(lián)合培養(yǎng)

生物可降解的明膠微冰膠由清華大學(xué)生物工程系制備，將冷水魚明膠與3%戊二醛溶液按6%的質(zhì)量體積比混合，利用PMM微孔模板技術(shù)低溫下制備成的顆粒狀三維支架材料，制備方法簡單、周期短。首先收集狀態(tài)良好的三代ADSCs并計(jì)數(shù)，重懸細(xì)胞沉淀，以50 μL體積、1.2×107個(gè)/mL鋪于一個(gè)膠塊上，置于5% CO2和95%濕度的37 ℃培養(yǎng)箱1.5～2 h，使細(xì)胞充分貼附在材料中，然后補(bǔ)足培養(yǎng)皿所需培養(yǎng)基，獲得三維明膠微冰膠支架材料(3D)中ADSCs。設(shè)置普通二維生長環(huán)境(2D)中ADSCs作為對照。

1.3 種植于明膠微冰膠中ADSCs活細(xì)胞染色

從培養(yǎng)皿中吸取數(shù)粒含有ADSCs的明膠顆粒狀材料置于48孔板，D-Hank’s洗掉培養(yǎng)基。避光配制死活細(xì)胞染色液，PI(10 μg/mL)和Calcein-AM(2 μmol/L)稀釋于D-Hank’s中。將該混合物加入48孔板中，37 ℃孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 Cell Titer-Blue?細(xì)胞活力檢測

以1.2×107個(gè)/mL接種ADSCs，比較細(xì)胞在普通二維生長環(huán)境(2D)和三維明膠微冰膠支架材料(3D)增殖能力，具體操作方法按照說明書進(jìn)行。

1.5 2D和3D中ADSCs成脂成骨誘導(dǎo)過程

以2×104個(gè)/mL將ADSCs鋪于6孔板，待細(xì)胞增殖至培養(yǎng)皿60%和80%，分別添加成骨和成脂誘導(dǎo)液，于誘導(dǎo)第5天進(jìn)行成骨堿磷酶染色，于第10天進(jìn)行成脂油紅O和成骨茜素紅染色。以1.2×107個(gè)/mL接種ADSCs于明膠微冰膠中，誘導(dǎo)方法同上，收集RNA鑒定成脂成骨相關(guān)基因表達(dá)情況。

1.6定量PCR檢測2D和3D中ADSCs干性基因表達(dá)情況

用Trizol法提取體外2D和3D培養(yǎng)環(huán)境中ADSCs的RNA，測定RNA濃度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。Real-time PCR按照試劑盒說明書進(jìn)行。RT-PCR引物序列(表1)，以GAPDH作為內(nèi)參。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1ADSCs和明膠微冰膠形態(tài)及其聯(lián)合培養(yǎng)后活細(xì)胞染色結(jié)果

ADSCs培養(yǎng)擴(kuò)增至第3代后細(xì)胞增殖形態(tài)比較一致(圖1A)。明膠微冰膠制備后呈現(xiàn)于培養(yǎng)皿，電鏡照片顯示明膠微冰膠是帶有空隙的三維立體結(jié)構(gòu)(圖1B)，肉眼觀察到材料顆粒是直徑400 μm的白色柱狀實(shí)體(圖1C)。這種材料需經(jīng)過進(jìn)一步凍干處理，存于-20 ℃?zhèn)溆?，進(jìn)而形成厚度600 μm左右圓形或者方形片狀的顆粒聚集體(圖1D)。在細(xì)胞和材料體內(nèi)應(yīng)用前，活細(xì)胞染色顯示材料中細(xì)胞大部分處于存活狀態(tài)(Calcein-AM：陽性綠色)(圖1E,G)，僅有少部分細(xì)胞死亡(PI:陽性紅色)(圖1F,G)。

2.2ADSCs在明膠微冰膠中增殖情況和干性基因表達(dá)情況

以1.2×107個(gè)/mL接種，初始細(xì)胞數(shù)量相同，結(jié)果顯示連續(xù)培養(yǎng)3 d兩組間的細(xì)胞增殖無區(qū)別(圖2A)。同時(shí)還分析了ADSCs干性基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示培養(yǎng)12 h后OCT4、Nanog表達(dá)水平在3D環(huán)境中明顯高于2D(圖2B)。

A.ADSCs morphology(×10)；B～D.gelatin microcryogels morphology,B(×100),D(×20)；E～G.ADSCs staining in gelatin microcryogels of Calcein-AM and PI(×20)

A.ADSCs proliferation；B.expression of stemness genes OCT4， Nanog,SOX2 in gelatin microcryogels (3D) compared to 2D； *P<0.05，**P<0.01 compared with ADSCs

2.3ADSCs在二維環(huán)境和三維明膠微冰膠中成脂成骨分化能力比較

3種染色結(jié)果顯示,普通二維培養(yǎng)條件和明膠微冰膠三維培養(yǎng)條件下，ADSCs都具有向成脂和成骨分化的能力(圖3)。明膠微冰膠中ADSCs在誘導(dǎo)5和10 d時(shí)，成脂分化相關(guān)基因PPARγ、AP2、LPL以及成骨分化基因RUNX2、OPN、OC表達(dá)水平均比二維誘導(dǎo)環(huán)境降低(圖4A～F)。

A～B.oil red O staining adipogenic differentiation of ADSCs(×10)；C～D.ALP staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)； E～F.Alizarin red S staining osteogenic differentiation of ADSCs(×4)；A,C,E(2D); B,D,F(3D)

A～C.adipogenic genes expression；D～F.bone differentiation related gene expression；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.01 compared with ADSCs+microcryogels

3 討論

干細(xì)胞微環(huán)境對干細(xì)胞命運(yùn)決定非常關(guān)鍵，包括體內(nèi)和體外微環(huán)境兩方面。不同的環(huán)境因素，如干細(xì)胞和干細(xì)胞之間、干細(xì)胞和臨近分化細(xì)胞之間相互作用，以及干細(xì)胞受到周圍黏附分子、細(xì)胞外基質(zhì)成分、氧張力、生長因子、細(xì)胞因子，理化環(huán)境中pH、離子強(qiáng)度、代謝產(chǎn)物影響，都會(huì)改變基因表達(dá)，誘導(dǎo)其增殖或者分化，從而影響干細(xì)胞參與組織再生、維持和修復(fù)過程[2]。

種子細(xì)胞、組織工程支架、細(xì)胞因子是構(gòu)成組織工程的3 大因素，分別相當(dāng)于田地里的種子、土壤、化肥。作為“土壤”的組織工程支架起細(xì)胞外基質(zhì)作用，不但為種子細(xì)胞提供附著、生長、增殖的場所，而且向種子細(xì)胞傳輸化學(xué)和力學(xué)信號,指導(dǎo)種子細(xì)胞的誘導(dǎo)分化、基因表達(dá)，使其再生或修復(fù)組織[4- 5]。

本研究顯示ADSCs在明膠微冰膠中能夠正常增殖，活性較高，與ADSCs在普通二維生長環(huán)境相比差別不明顯。進(jìn)一步分析干細(xì)胞標(biāo)記基因OCT- 4、SOX- 2和Nanog[6]在二維和三維環(huán)境中的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在明膠微冰膠中ADSCs干性基因表達(dá)水平高于二維生長環(huán)境。這部分結(jié)果提示明膠微冰膠作為細(xì)胞載體提供了一個(gè)比普通二維更好的環(huán)境因素，不但保持了ADSCs較強(qiáng)的增殖能力，而且提高了ADSCs干性基因表達(dá)水平。此外，種植于明膠微冰膠三維支架材料中的ADSCs在成脂成骨誘導(dǎo)環(huán)境下，成脂和成骨染色結(jié)果顯示具有相似的成脂成骨分化能力，但是相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)沒有普通二維誘導(dǎo)環(huán)境顯著。結(jié)合干性基因的檢測結(jié)果提示明膠微冰膠三維支架材料提供的環(huán)境因素更有利于ADSCs維持干性。 另外，明膠微冰膠材料在體內(nèi)應(yīng)用時(shí)，優(yōu)勢在于可以采用直接輸注的方式，因此有利于提高ADSCs的體內(nèi)應(yīng)用價(jià)值。

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Gelatin microcryogels benefit human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue to maintain stemnessinvitroand promote application valueinvivo

MAO Xiao-jing1, ZENG Yang2, HAN Qin1*, ZHAO Chun-hua1*

(1.Center of Excellence in Tissue Engineering, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS, Beijing 100005；2.Dept. of Biomedical Engineering, School of Medicine, Tsinghua University, Beijing 100084, China)

ObjectiveTo investigate whether the gelatin microcryogels can maintain biological characteristics of human mesenchymal stem cells from adipose tissue (ADSCs) and enhance the stemness of ADSCs when they are co-culturedinvitro.MethodsCalcein-AM and PI staining were conducted to test cell viability of ADSCs plated in gelatin microcryogels. Cell titer-blue assay was used to examine the cellular proliferating capacity. Real-time PCR was used to evaluate the expression level of the stemness genesOCT4,Nanog,SOX2. Adipogenic and osteogenic differentiation were induced and compared in ADSCs plated in gelatin microcryogels and in conventional environment.ResultsADSCs were biologically active in the 3D scaffolds of gelatin microcryogels. Proliferation rate was not influenced. Stemness genes expression was up-regulated. ADSCs plated in gelatin microcryogels still had osteogenic and adipogenic differentiation ability, but the related genes expression levels were lower in comparison with ADSCs in conventional inducing condition.ConclusionsGelatin microcryogels can provide proper microenvironmental factors for ADSCs stemness maintenance, so as to exert the long-term application value in the diseases treated

human mesenchymal stem cells from adipose tissue(hADSCs); gelatin microcryogels

2015- 01- 11

：2015- 03- 13

國家重大科學(xué)研究計(jì)劃(2011CB964901)

*通信作者(correspondingauthor)：hanqinhanqin@126.com；zhaochunhua@vip.163.com

1001-6325(2015)05-0610-05

研究論文

Q813.1

：A

with stem cell by a minimally-invasive delivery method.