游 偉，劉映峰，張杰波，林湧灤，繆 緋，劉 芃

(南方醫(yī)科大學(xué) 珠江醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510282)

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HBSP抑制缺氧復(fù)氧心肌H9C2細(xì)胞Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位及細(xì)胞凋亡

游 偉，劉映峰，張杰波，林湧灤，繆 緋，劉 芃*

(南方醫(yī)科大學(xué) 珠江醫(yī)院 心血管內(nèi)科，廣東 廣州 510282)

目的探討促紅細(xì)胞生成素衍生肽(HBSP)對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位及細(xì)胞凋亡的影響。方法將乳鼠心肌細(xì)胞(H9C2 細(xì)胞)分為對(duì)照(Ctrl)組、缺氧復(fù)氧(H/R)組、HBSP組和EPO組。培養(yǎng)結(jié)束后MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH釋放率，Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase- 3表達(dá)，TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡；分離H9C2細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體，Western blot分別檢測(cè)線粒體及細(xì)胞質(zhì)Omi/HtrA2表達(dá)。結(jié)果與Ctrl組相比，H/R 組細(xì)胞存活率下降(P<0.05)，LDH釋放、cleaved caspase- 3表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡及Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位均明顯上升(P<0.05)；與H/R組相比，EPO組的細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，LDH釋放降低、cleaved caspase- 3表達(dá)減弱、心肌細(xì)胞凋亡減少、Omi/HtrA2線粒體轉(zhuǎn)位明顯減少(P<0.05)；隨著HBSP濃度的增加，各組細(xì)胞存活率逐漸上升，LDH釋放、cleaved caspase- 3表達(dá)、心肌細(xì)胞凋亡及Omi/HtrA2胞內(nèi)轉(zhuǎn)位率逐漸下降 (P<0.05)。結(jié)論HBSP具有與EPO類似的保護(hù)作用，可抑制經(jīng)H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過減少Omi/HtrA2蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，抑制caspases通路激活，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

缺氧復(fù)氧；促紅細(xì)胞生成素衍生肽；促紅細(xì)胞生成素；細(xì)胞凋亡；Omi/HtrA2

在現(xiàn)階段急性心肌梗死患者的再灌注治療中，無論是溶栓還是冠脈介入治療，心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)都是臨床醫(yī)生無法回避的問題及難以攻克的治療難點(diǎn)。然而缺血/再灌注(I/R)的機(jī)制至今仍未完全闡明，目前臨床上尚無有效的治療方法。近10年來，體內(nèi)外大量的實(shí)驗(yàn)[1- 2]證實(shí)促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)在心肌梗死、MIRI、心力衰竭等模型中起到良好的心肌保護(hù)作用。然而，近年來幾個(gè)大型臨床研究中[3- 6]，EPO因血栓及高血壓等不良反應(yīng)，使其臨床推廣受到限制。HBSP是由EPO 3級(jí)結(jié)構(gòu)衍生而來的具有11 個(gè)氨基酸(序列為QEQLERALNSS)的新型多肽，其生物多效性近年來被廣泛證實(shí)。HBSP在缺血再灌注、炎性反應(yīng)、神經(jīng)創(chuàng)傷等多種生物模型中具有與EPO相似的組織保護(hù)作用，又無促紅細(xì)胞生成的不良反應(yīng)[7]。國(guó)外最新研究證實(shí)，在充血性心力衰竭及心肌梗死模型中，HBSP具有和EPO類似的心臟保護(hù)作用。然而HBSP對(duì)MIRI的影響鮮有報(bào)道。本研究細(xì)胞通過體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，建立H/R細(xì)胞損傷模型，觀察HBSP對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位率的影響，并探討HBSP發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

H9C2 細(xì)胞(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室)、胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、青霉素、PBS磷酸鉀緩沖液和HBSP(上海科肽生物科技有限公司)；重組EPO注射液(山東科興生物制品有限公司)；cellTiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(Promega公司)；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；Cleaved caspase- 3多抗、GAPDH單抗、COX IV單抗、Omi/HtrA2單抗(Cell Signaling公司)；Pluslight ECL kit (ECL發(fā)光試劑盒)(Forevergen Bioscience公司)；原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)試劑盒(Roche公司)；線粒體胞質(zhì)分離試劑盒(Qiagen公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組： 將H9C2細(xì)胞分為：1)對(duì)照組(Ctrl)：細(xì)胞用DMEM-高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)26 h，不作任何處理；2)缺氧復(fù)氧組(H/R)：將待處理細(xì)胞、厭氧袋及氧氣指示劑放入?yún)捬豕?，將厭氧罐置于?xì)胞培養(yǎng)箱，待氧氣指示劑從淺紫色變成粉紅色示無氧狀態(tài)，開始計(jì)時(shí)缺氧時(shí)間，缺氧時(shí)間定為2 h，重新將細(xì)胞放置培養(yǎng)箱即為復(fù)氧狀態(tài)，復(fù)氧24 h；3)HBSP組：同缺氧復(fù)氧組，在缺氧2 h加入不同濃度的HBSP(2.5、5和10 ng/mL)處理，然后復(fù)氧24 h。4)EPO組：同缺氧復(fù)氧組，在缺氧2 h后加入(40 IU/mL)的EPO，然后復(fù)氧24 h。

1.2.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞存活率： 取指數(shù)增殖期細(xì)胞消化吹散并調(diào)整細(xì)胞至1×105/mL，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行處理，處理后的細(xì)胞加入cellTiter96AQ單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑，試劑與培養(yǎng)液比例為1∶10，孵育4 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)讀取各樣本AD490數(shù)據(jù)，得出的數(shù)據(jù)通過與對(duì)照組比較計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 細(xì)胞上清液LDH濃度檢測(cè)： 按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)結(jié)束后，提取上清液按照乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒說明書操作，測(cè)量細(xì)胞LDH釋放率：

1.2.4 Western blot檢測(cè)cleaved caspase- 3表達(dá): 蛋白用Bradford法定量后，采用15%濃度的聚丙烯酰胺凝膠測(cè)cleaved caspase3，經(jīng)SDS-PAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，將相應(yīng)的一抗cleaved caspase- 3(Cell Signaling公司#9661，1∶1 000)，4 ℃過夜后，用TBST每次7 min洗兩次后，用相應(yīng)的稀釋好的二抗(HRP標(biāo)記二抗，1∶5 000，F(xiàn)orevergen公司)室溫下孵育1～2 h后，用TBST每次7 min洗3次后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影(ECL，F(xiàn)orevergen公司)。用Image J分析目標(biāo)條帶的吸光度值，比較各組cleaved caspase3/GAPDH(HC301,1∶5 000)吸光度的差異。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡: 根據(jù)TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，以LSM710型激光掃描共聚焦顯微鏡觀察記錄結(jié)果。每組細(xì)胞計(jì)數(shù)10個(gè)隨機(jī)高倍視野中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)和總細(xì)胞核數(shù)。計(jì)算TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞核數(shù)的百分比即為凋亡率。

1.2.6 分離H9C2細(xì)胞胞質(zhì)及線粒體，Western blot分別檢測(cè)線粒體及細(xì)胞質(zhì)Omi/HtrA2蛋白表達(dá)：選取10 ng/mL HBSP組細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，按照線粒體胞質(zhì)分離試劑盒說明書分離線粒體蛋白及胞質(zhì)蛋白，Western blot檢測(cè)各組Omi/HtrA2蛋白表達(dá)，計(jì)算其轉(zhuǎn)位率：

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞存活率變化

與Ctrl組相比，H/R組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05),細(xì)胞上清液LDH濃度明顯上升；與H/R組比較，HBSP的3個(gè)處理組細(xì)胞存活率逐漸升高, 各組細(xì)胞上清液LDH濃度逐漸回降(P<0.05)(表1)。

2.2 HBSP對(duì)細(xì)胞cleaved caspase- 3表達(dá)的影響

H/R組細(xì)胞cleaved caspase- 3表達(dá)較Ctrl組明顯升高(P<0.05)。與H/R組相比，HBSP的2個(gè)處理組(5、10 ng/mL)的cleaved caspase- 3表達(dá)逐漸回降(P<0.05)(圖1)。

表1 心肌細(xì)胞存活率及LDH釋放率的變化

*P<0.05 compared with Ctrl;#P<0.05 compared with H/R.

1.Ctrl；2.H/R；3.HBSP 2.5 ng/mL；4.HBSP 5 ng/mL；5.HBSP 10 ng/mL；6.EPO 40 IU/mL; *P<0.05 compared with Ctrl; #P<0.05 compared with H/R圖1 各組細(xì)胞中cleaved caspase- 3的相對(duì)表達(dá)水平Fig 1 Western blot analysis of cleaved caspase- 3

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡率的比較

與Ctrl組相比，H/R組心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與H/R組相比，HBSP的2個(gè)處理組(5、10 ng/mL)及EPO組細(xì)胞凋亡率均明顯回降(P<0.05)(圖2)。2.4胞質(zhì)及線粒體中Omi/HtrA2蛋白的表達(dá)情況

Ctrl組中Omi/HtrA2蛋白主要在線粒體內(nèi)(mitochondrion，Mito)表達(dá)，在胞質(zhì)(cytoplasma，Cyto)表達(dá)極少；H/R組中Omi/HtrA2蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)明顯增加，在線粒體內(nèi)表達(dá)減少，說明缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)Omi/HtrA2蛋白由線粒體向胞質(zhì)轉(zhuǎn)位；而HBSP組和EPO組的Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位減少，說明HBSP和EPO均可抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的Omi/HtrA2轉(zhuǎn)位(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with ctrl group; #P<0.05 compared with H/R group圖2 TUNEL法檢測(cè)各組心肌細(xì)胞凋亡率Fig 2 The apoptosis of cardiomyocytes in different groups examined by TUNEL staining(×100)

1.Ctrl；2.H/R；3.HBSP 10 ng/mL；4.EPO 40 IU/mL；A，B.expression of Omi/HtrA2 in Cyto(A) and Mito (B)； GAPDH: Cyto marker; COXⅣ:Mito marker; *P<0.05 compared with Ctrl group; #P<0.05 compared with H/R group

3 討論

在過去的10年里，EPO的生物多效性，尤其是對(duì)MIRI的保護(hù)作用被廣泛證實(shí)[8]。由于EPO需要大劑量才能發(fā)揮組織保護(hù)作用，而大劑量EPO的不良反應(yīng)(如高凝狀態(tài)、血栓和高血壓等)難以避免，EPO發(fā)揮組織保護(hù)效應(yīng)在臨床難以推廣。HBSP是從EPO的三級(jí)結(jié)構(gòu)helix B 段親水表面中篩選合成而來，沒有促紅細(xì)胞生成的不良反應(yīng)。通過擴(kuò)張型心肌病倉(cāng)鼠模擬充血性心力衰竭模型，發(fā)現(xiàn)HBSP可抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[9]；有研究[10]通過大鼠心肌梗死模型發(fā)現(xiàn)HBSP能減小梗死面積，減少左室擴(kuò)張，提高活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)釋放閾值，具有與EPO同樣的保護(hù)效果；另有實(shí)驗(yàn)[11]證實(shí)HBSP抑制經(jīng)C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低經(jīng)C反應(yīng)蛋白誘導(dǎo)THP- 1細(xì)胞TNF-α和MM9的表達(dá)減輕巨噬細(xì)胞泡沫化，顯著抑制心肌梗死兔子冠脈TNF-α表達(dá)和減少M(fèi)1巨噬細(xì)胞；此外，在構(gòu)建大鼠MIRI模型的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HBSP 可顯著抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡，大鼠心肌梗死面積亦顯著減少，心功能明顯改善[12]。綜上所述，目前HBSP對(duì)心臟保護(hù)作用逐漸被證實(shí)，然而在MIRI方面，HBSP能否像EPO一樣減輕MIRI以及其具體保護(hù)機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過建立心肌細(xì)胞H/R模型，證實(shí)HBSP可抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞LDH、caspase- 3表達(dá)增加，減少H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率，同時(shí)觀察到HBSP可抑制H/R心肌細(xì)胞Omi/HtrA2蛋白的胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。

Omi/HtrA2蛋白是一種新近發(fā)現(xiàn)的促凋亡蛋白，在蛋白質(zhì)修復(fù)和細(xì)胞凋亡中有重要作用。Omi/HtrA2在細(xì)胞正常生理情況下存在于線粒體膜間隙，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)完成自我加工，通過與X-連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制XIAP與caspase- 9的結(jié)合，進(jìn)而激活處于下游的caspase- 3蛋白表達(dá),引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比Ctrl組，H/R組Omi/HtrA2蛋白由線粒體轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)中明顯增多，而HBSP組隨HBSP濃度增加Omi/HtrA2蛋白的轉(zhuǎn)位率逐漸減少，提示HBSP可能是通過抑制Omi/HtrA2蛋白由線粒體轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)，進(jìn)而影響Omi/HtrA2對(duì)下游caspase- 9及caspase- 3通路激活作用, 最終減少細(xì)胞凋亡。誠(chéng)然HBSP抑制細(xì)胞凋亡可能涉及多種因子，其具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究為HBSP的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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新聞點(diǎn)擊

60歲以下女性患糖尿病恐將提高心臟病風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNAS)網(wǎng)站2013-11-07報(bào)道，一般而言，在60歲以下患冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)，同年齡層的女性比男性要低，但最近發(fā)表的一項(xiàng)美國(guó)研究卻進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，若本身有心臟病的風(fēng)險(xiǎn)因子之一“糖尿病”，將對(duì)這些女性產(chǎn)生與男性不同的影響。

目前約翰霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院針對(duì)3份研究中包含超過1萬(wàn)名男女參與者的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有參與者都無心臟病病史。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60歲以下年輕與中年女性有2型糖尿病的話，她們患冠狀動(dòng)脈疾病的機(jī)會(huì)就大幅提高，風(fēng)險(xiǎn)增加了將近4倍之多，該風(fēng)險(xiǎn)數(shù)值已大致與男性心臟病風(fēng)險(xiǎn)相當(dāng)。不過，糖尿病影響心臟病風(fēng)險(xiǎn)的情形卻在相同年齡層的男性身上并不明顯。

研究表示，其他風(fēng)險(xiǎn)因子如肥胖、高血壓、糖尿病與吸煙對(duì)患心臟病的影響在研究中都未被發(fā)現(xiàn)有任何性別差異，唯獨(dú)糖尿病對(duì)女性心臟病的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過男性。研究推測(cè)可能有不同的基因及激素因素影響著不同性別心臟病的發(fā)展過程，同時(shí)，不同性別對(duì)于醫(yī)囑與治療的順從程度也不一，這也可能是造成差異的原因之一，未來將需要更進(jìn)一步的研究。

他汀類降血脂藥物(Statins)恐提高患白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(PNAS)網(wǎng)站2013-11-08報(bào)道，過去針對(duì)降血脂藥物Statins的討論包括質(zhì)疑該類藥物對(duì)女性的效益不如男性，以及去年美國(guó)食品藥物管理局要求該類藥物應(yīng)加注提高短暫性記憶認(rèn)知受損、及血糖升高的警語(yǔ)。日前又有一項(xiàng)美國(guó)研究指出，使用Statins藥物者比未使用者發(fā)生白內(nèi)障眼疾的風(fēng)險(xiǎn)高，而這個(gè)爭(zhēng)議性的發(fā)現(xiàn)早在1980年代藥物出現(xiàn)時(shí)就曾被提出。

有關(guān)于Statins與白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，過去有些研究證實(shí)其中因果關(guān)系，但也有其他研究卻發(fā)現(xiàn)該類藥物對(duì)預(yù)防白內(nèi)障具有保護(hù)作用，出現(xiàn)兩種截然不同的結(jié)論。由于Statins類藥物越來越常被用來作為初級(jí)預(yù)防用途，且白內(nèi)障使生活質(zhì)量受影響及造成美國(guó)健康照護(hù)支出的負(fù)擔(dān)也非常大，因此這個(gè)問題相當(dāng)重要。

這項(xiàng)回溯性研究針對(duì)過去兩個(gè)共包含超過4萬(wàn)名參與者的研究進(jìn)行分析，第一個(gè)研究參與者的平均年齡56歲，女性占46%；第2個(gè)研究參與者使用Statins的平均年齡為56歲、未使用者為46歲，兩組中的女性各占40%和52%。

最后分析兩個(gè)研究的結(jié)果顯示，使用Statins藥物都與發(fā)生白內(nèi)障呈現(xiàn)顯著的正向相關(guān)性，壞膽固醇(LDL)的數(shù)值愈低時(shí)，白內(nèi)障風(fēng)險(xiǎn)反而愈高。其中一個(gè)計(jì)算出與未使用Statins相比的風(fēng)險(xiǎn)增加數(shù)據(jù)為9%(95% CI 1.02～1.17)。

白內(nèi)障及青光眼主治醫(yī)生Anurag Shrivastava評(píng)論此研究時(shí)表示，這項(xiàng)研究無法提供使用Statins藥物的患者預(yù)防白內(nèi)障的建議，但就一般而言，還是以維持均衡飲食、健康的生活形態(tài)、不抽煙及減少暴露于紫外線，并對(duì)糖尿病進(jìn)行嚴(yán)格血糖控制為基本預(yù)防建議，同時(shí)，醫(yī)生應(yīng)小心Statins使用者有無并服類固醇，服用這些藥物可能會(huì)增加白內(nèi)障及青光眼的發(fā)生。

HBSP inhibits transposition of Omi/HtrA2 and apoptosis of myocardial cells induced by anoxia-reoxygenation

YOU Wei, LIU Ying-feng, ZHANG Jie-bo, LIN Yong-luan, MIAO Fei, LIU Peng*

(Dept. of Cardiovascular Medicine, Zhujiang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510282，China)

ObjectiveTo investigate the effect of helix B surface peptide(HBSP) on transposition of Omi/HtrA2 and apoptosis of myocardial cells induced by anoxia-reoxygenation.MethodsNeonatal rat myocardial cells (H9C2 cells) were used to be research object, the cells were divideded into 4 groups：control group, H/R group, HBSP group and EPO group. The cell viability was measured by MTS assay, the concentration of LDH of cell supernatant was assessed by ELISA, the intracellular expression changes of cleaved caspase-3 was detected by Western blot. Apoptosis of cardiomyocytes was detected by TUNEL.Using mitochondria/cytosol isolation kit to isolate mitochondria from cytosol, Western blot was used to detect the expression of Omi/HtrA2 protein changes in the mitochondrial and cytosolic.ResultsCompared with the control group, H/R group cell survival rate decreased significantly(P<0.05), cell supernatant LDH concentration increased significantly,the expression of cleaved caspase- 3 increased, the cardiomyocyte

anoxia-reoxygenation; HBSP; EPO; apoptosis; Omi/HtrA2

2014- 11- 04

：2015- 01- 23

廣東省自然科學(xué)基金(10151051501000038); 廣東省科技計(jì)劃(20130319c)

*通信作者(correspondingauthor)：65473751@qq.com

1001-6325(2015)05-0615-06

研究論文

R541

：A

apoptosis and the expression of Omi/HtrA2 protein in the cytoplasm increased significantly (P<0.05). Compared with H/R group, EPO and HBSP group cell survival rate increased, cell supernatant concentrations of LDH, cleaved caspase- 3, cardiomyocyte apoptosis and the Omi/HtrA2 protein in the cytoplasm expression decreased significantly (P<0.05).ConclusionsH/R can induce apoptosis of myocardial cell,which can be reduced by EPO or HBSP,its mechanism may be related to the inhibition of Omi/HtrA2 protein in mitochondrial translocation, thus inhibiting the caspases pathway activation.