左馬怡，楊 超，田 倩，羅 陽，楊 淬，曾 亮，李干鵬

(云南民族大學民族藥資源化學國家民委－教育部重點實驗室，云南昆明650500)

甘青青蘭(Dococe Phalumtanguticum Maxim.)系唇形科(Labiatae)青蘭屬(Dracocephalum)多年蔓生草本植物［1］，別名唐古特青蘭、隴塞青蘭，藏名譯音:知羊故、知羊高.甘青青蘭是一種傳統(tǒng)中藥，其性寒，味甘、苦，具有香味;有和胃疏肝、清熱利水、止咳化痰等功能，是藏醫(yī)常用唇形科草本植物藥材，一般用其的地上干燥部分入藥，可治創(chuàng)傷、潰瘍、頭暈、胃炎、關節(jié)炎和肝炎等癥［2］.其常生長于海拔1 900～4 600 m的地方，在干燥河谷的谷岸、山野路旁、草灘或高山草地、田邊及松林邊緣生長.主要分布于西藏(東部)、青海(東南部)、甘肅(西南部)以及四川(西部)等地［3］.

青蘭屬植物化學成分復雜，主要可分為揮發(fā)油類、黃酮及黃酮苷類、植物甾醇類、有機酸及其酯類、無機元素等，國內(nèi)外研究報道多為黃酮類化合物，也有二萜、三萜等［4］;為了更好地開發(fā)利用這一藥用植物資源，搞清甘青青蘭的藥效物質(zhì)基礎，對甘青青蘭乙醇提取液的化學成分進行研究，并對其中部分化合物做抗腫瘤活性測定;以期對今后甘青青蘭的藥理研究、臨床應用，以及藏藥的新藥研發(fā)提供有效的科學依據(jù).

1 實驗部分

1.1 實驗藥材、主要試劑與儀器

儀器:核磁共振譜儀AVANCEⅢ(瑞士BRUKER公司);旋轉蒸發(fā)儀N－1100D－WD(上海EYELA儀器有限公司);暗箱式紫外分析儀ZF－20D(鞏義市予華儀器有限公司);紅外分光光度計Nicoiet Is10(美國賽默飛世爾科技有限公司;高效液相色譜儀安捷倫1200(美國安捷倫公司).

試劑:甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇等有機試劑均為分析純，水為純凈水.

藥材:甘青青蘭全草于2013年8月購于云南省迪慶自治州藏醫(yī)院，植物標本經(jīng)藏醫(yī)阿榮鑒定.

1.2 提取與分離

將采集的甘青青蘭全草7.8 kg，經(jīng)粉碎機粉碎(過0.216nm篩)，用95%的乙醇浸泡在25 L的滲漉桶中，冷提4次，每次5～7滴.提取液過濾、在56℃水浴下用旋轉蒸發(fā)儀將提取液減壓濃縮，回收溶劑，然后水浴揮干，得總浸膏約780 g.將適量溫水加入所得浸膏中使其溶解，分別用乙酸乙酯、正丁醇于室溫下連續(xù)萃取4次，將不同萃取液分別合并，用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，依次制得甘青青蘭不同極性部位萃取物:乙酸乙酯部分浸膏約72 g、正丁醇部分浸膏約123 g、水相部分浸膏206 g.將乙酸乙酯部位上硅膠柱層析，用氯仿/甲醇為洗脫劑梯度洗脫，收集各組分，再經(jīng)反復柱色譜分離、純化，得到化合物1(7.1 mg)、化合物2(22.8 mg)、化合物3(5.8 mg)、化合物4(11.7 mg)、化合物5(7.9 mg)、化合物6(7.2 mg).

2 結果與討論

2.1 結構鑒定

化合物1 分子式為C18H16O8;深褐色粉末，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.27(1H，d，J=1.6 Hz，H －2)，7.07(1H，d，J=7.9 Hz，H －5)，7.02(1H，dd，J=1.9，8.0 Hz，H －6)，7.77(1H，d，J=16.0 Hz，H － 7)，6.49(1H，d，J=15.6 Hz，H － 8)，6.13(1H，d，J=4.0 Hz，H －2.)，6.88(1H，d，J=8.4 Hz，H－5')，3.57(2H，m，H －7')，5.49(m，H －8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.1(C －1)，114.0(C －2)，146.2(C －3)，147.7(C －4)，116.4(C －5)，123.2(C －6)，147.7(C －7)，116.4(C －8)，168.5(C －9)，129.0(C －1')，117.5(C －2')，146.2(C －3')，144.8(C －4')，116.2(C －5')，121.8(C －6')，37.5(C －7')，74.4(C－8').以上數(shù)據(jù)與文獻［5］報道一致，化合物1鑒定為迷迭香酸.

化合物2 分子式為C19H18O8;黃色粉末，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.05(1H，d，J=2.0 Hz，H －2)，6.58(1H，d，J=1.6 Hz，H －5)，6.80(1H，dd，J=4.4，8.0 Hz，H － 6)，7.57(1H，d，J=16.0 Hz，H －7)，6.28(1H，d，J=14.6 Hz，H － 8)，6.95(1H，d，J=1.6 Hz，H －2')，6.72(1H，d，J=2.0 Hz，H －5')，3.04(2H，m，H －7')，5.21(1H，dd，J=5.2 Hz，11.6，H － 8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.5(C －1)，114.0(C －2)，146.6(C －3)，147.9(C －4)，116.2(C －5)，123.2(C －6)，147.9(C －7)，116.4(C －8)，168.3(C －9)，128.7(C －1')，117.1(C －2')，146.6(C －3')，145.2(C －4')，117.5(C －5')，120.8(C －6')，37.7(C －7')，74.8(C－8')，52.6(－OCH3).以上數(shù)據(jù)與文獻［5］報道一致，化合物2鑒定為迷迭香酸甲酯.

化合物3 分子式為C10H11O5;黃色粒狀，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.67(1H，d，J=9.6 Hz，H －5)，6.53(s，br，H －6)，7.91(1H，d，J=6.4 Hz，H －8)，3.34(3H，s，－ COOCH3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:129.7(C －1)，117.5(C －2)，145.0(C －3)，146.0(C －4)，116.1(C －5)，121.7(C －6)，73.3(C －8)，175.8(C －9).以上數(shù)據(jù)與文獻［6］報道一致，化合物3鑒定為2，3－2H－3－羥基－咖啡酸甲酯.

化合物4 分子式為C9H8O4;黃色結晶，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.93(1H，d，J=8.0 Hz H －2)，6.78(1H，d，J=2.4 Hz H －5)，7.55(1H，d，J=2.4 Hz，H － 7)，6.23(1H，J=2.4 Hz，H －8);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.7(C －1)，115.1(C －2)，146.7(C －3)，147.0(C －4)，116.4(C －5)，122.8(C －6)，147.0(C －7)，115.5(C－8)，171.0(C－9).以上數(shù)據(jù)與文獻［6］報道一致，化合物4鑒定為咖啡酸.

化合物5 分子式為C7H6O3;白色針狀結晶，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.88(2H，dd，J=8.0 Hz，2 －H，6 －H)，6.81(2H，m，3 －H，5 －H);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:132.9(C －1)，133.2(C －2，C －6)，114.2(C －3，C －5)，163.1(C－4)，170.1(C －7).以上數(shù)據(jù)與文獻［7］報道一致，化合物5鑒定為對羥基苯甲酸.

化合物6 分子式為C7H6O4;黃色片狀，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.41(1H，d，J=0.8 Hz，H －2)，6.76(1H，d，J=8.0 Hz，H －5)，7.44(s，br，H － 6)，6.23(1H，J=2.4 Hz，H － 8);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.1(C －1)，114.4(C －2)，144.3(C －3)，147.0(C －4)，116.4(C －5)，122.6(C －6)，171.2(C －7).以上數(shù)據(jù)與文獻［8］報道一致，化合物6鑒定為原茶酸.

2.2 抗腫瘤活性測定

將對數(shù)生長期的腫瘤細胞Hep G2、Hela、肺癌細胞株用0.25% 胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清，1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)液吹打制成細胞懸液，分別將腫瘤細胞稀釋至5.0×10－4mg/mL，再將其接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔加入198 μL腫瘤細胞懸液，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h.待細胞完全貼壁后，各實驗組每 孔 加 入 含 不同 濃 度(10－4、10－5、10－6、10－7mmol·L－1)待測化合物 2 μL.陰性對照組加入含等體積藥物溶劑的DMEM培養(yǎng)液200 μL.另單設不含細胞的DMEM培養(yǎng)液200 μL為空白對照組.陽性對照組采用以上相同濃度和體積的 DDP.每一個濃度設3個平行孔，培養(yǎng)24 h后各孔分別加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，再培養(yǎng)4 h后，吸去各孔培養(yǎng)液，分別加入100μL DMSO，震蕩20 min后用酶標儀在570 nm波長處測定各孔吸收度(OD)值.用以下公式計算藥物各個質(zhì)量濃度對腫瘤細胞的抑制率:

抑制率(%)=［1－(OD實驗 －OD空白)/(OD對照－OD空白)］×100%

以同一藥物的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖，可得到劑量反應曲線，根據(jù)線性回歸方程求出該藥物對細胞生長抑制率(IC50).

實驗對分離提取的單體化合物1、2、3進行了體外抗腫瘤活性測定，結果表明3個化合物對Hep G－2、Hela、肺癌細胞株均有一定的抗腫瘤活性.化合物1對Hela細胞株具有較好體外抗腫瘤活性.化合物3對Hep G－2和肺癌細胞株具有較好的抗腫瘤活性.

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對Hela，Hep G－2、肺癌細胞株的IC50 μmol·L－1

3 結語

從甘青青蘭乙酸乙酯部位中分離得到6個化學物.通過現(xiàn)代波譜技術對它們進行結構鑒定，6個化合物分別為迷迭香酸(1)，迷迭香酸甲酯(2)，2，3－2H－3－羥基－咖啡酸甲酯(3)，咖啡酸(4)，對羥基苯甲酸(5)，原茶酸(6).并對其中3個化合物進行了抗腫瘤活性測定，化合物1、3具有較好的體外抗腫瘤活性，值得進一步深入研究.

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草:藏藥卷［M］.上海:上?？茖W技術出版社，2002:278－279.

［2］南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典［M］.2版.上海:上?？茖W技術出版社，2006:2687－2688.

［3］中國科學院西北為原生物研究所.藏藥志［M］青海:青海人民出版社，1991:183.

［4］劉建英，劉玉梅.青蘭屬植物的化學成分及藥理作用研究進展［J］.食品科學，2012，33(13):314 －319.

［5］高雪.三種菊科植物和一種唇形科植物化學成分及其生物活性研究［D］.蘭州:蘭州大學，2007.

［6］李云秋，馮育林，楊世林，等.刺山柑化學成分的研究［J］.中草藥，2007，38(4):510 －512.

［7］李靜，黎蓮娘.南丹參化學成分研究［J］.中草藥，1994，25(7):347－349.

［8］CHEN Z W，GU WH，WANG W Z.Study on the polyphenolic compounds of Salvia miltiorrhiza［J］.藥學學報，1981，9(16):24.