劉滿(mǎn)紅,劉曉芳,戴建輝,楊華倫,合雪陽(yáng)

(1.云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明650500；2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

云南肺衣中活性物質(zhì)提取工藝與抗氧化性能研究

劉滿(mǎn)紅1,2,劉曉芳1,2,戴建輝1,2,楊華倫1,2,合雪陽(yáng)1,2

(1.云南民族大學(xué) 云南省生物高分子功能材料工程技術(shù)研究中心，云南 昆明650500；2.云南民族大學(xué) 民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

對(duì)云南肺衣活性物質(zhì)提取工藝與抗氧化活性進(jìn)行了研究,結(jié)果表明，云南肺衣抗氧化活性物質(zhì)最佳提取工藝為：70%乙醇，料液比為1∶5，溫度60 ℃，提取時(shí)間3.0 h，提取液對(duì)·OH清除率為96.9%，IC50為14.7 mg/mL.

云南肺衣；提取工藝；抗氧化活性；羥自由基

地衣(lichens)是植物界一個(gè)特殊類(lèi)群，是真菌(fungi)和藻類(lèi)(algae)高度結(jié)合的共生復(fù)合體，全世界約有地衣植物500余屬，26 000 多種.它們分布極為廣泛，從南北兩極到赤道，從高山到平原，從森林到荒漠均有地衣植物的存在.地衣含有松蘿酸、珠光酸、苔色酸等多種獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，具有多方面的生物活性[1].近幾年的文獻(xiàn)報(bào)道從地衣植物中分離得到了許多具有活性的新化合物或新天然產(chǎn)物，而國(guó)內(nèi)對(duì)地衣化學(xué)成分方面的研究已有一些報(bào)道[2-3].而我國(guó)有豐富的地衣植物資源，尤其是在我國(guó)的西南地區(qū)，地衣植物在民間可以做藥用和食用，其中的云南肺衣(俗名青蛙皮)被大理白族視為純天然山珍食品.云南肺衣(Lobaria yunnanensis)為肺衣科(Lobariaeeae)肺衣屬(Lobaria)地衣植物，常附生于蘚及樹(shù)皮上,在外形上相似于東方肺衣、三苔色肺衣和中華肺衣.

自由基是指能獨(dú)立存在的含有1個(gè)或1個(gè)以上的不配對(duì)電子的任何原子或原子團(tuán),是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物，在機(jī)體內(nèi)有很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力且易產(chǎn)生連鎖反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等產(chǎn)生傷害作用,從而導(dǎo)致機(jī)體的損傷[4].大量的科學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧自由基與機(jī)體損傷有著非常密切的關(guān)系[5]，生物的抗病性、抗逆性及延緩衰老與抗氧化能力密切相關(guān)，為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一.本實(shí)驗(yàn)所采用的材料是來(lái)自云南大理蒼山的云南肺衣，對(duì)肺衣的抗氧化活性進(jìn)行研究，有助于發(fā)現(xiàn)具有較好生物活性的天然產(chǎn)物，對(duì)地衣植物的分類(lèi)也有一定的參考價(jià)值.

目前國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)到用蒼山云南肺衣活性物質(zhì)提取工藝優(yōu)化及抗氧化研究報(bào)道.本文用回流提取法提取植物中活性物質(zhì)，采用分光光度法，用鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基，作為評(píng)價(jià)清除羥基自由基(·OH) 的抗氧化能力，考察了提取時(shí)間、提取溫度、乙醇溶液濃度、料液比4個(gè)單因素的提取液對(duì)清除羥自由基的能力，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以云南肺衣提取物對(duì)羥自由基的清除率為評(píng)價(jià)值，對(duì)云南肺衣抗氧化成分的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在得到最佳的抗氧化活性物的提取工藝，對(duì)開(kāi)發(fā)具有天然抗氧化功能的產(chǎn)品,實(shí)現(xiàn)云南肺衣資源的綜合利用具有重要的意義.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與設(shè)備

材料：云南肺衣(購(gòu)于云南大理),將肺衣洗凈去除其它附屬藻類(lèi)植物，自然涼干，用粉碎機(jī)打碎成肺衣粉，封口袋密封保存.

試劑：鄰二氮菲溶液、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、pH 7.4磷酸緩沖溶液(PBS)、H2O2溶液；均為分析純.

儀器：HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(會(huì)壇市富華儀器有限公司)，9200型紫外分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)，循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng))，回流裝置，抽濾裝置.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取試劑的確定

以水、石油醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯做溶劑，對(duì)云南肺衣抗氧化活性成分的提取進(jìn)行了初探，其中乙醇提取液效果較好，故選擇乙醇作為提取溶劑.

1.2.2 云南肺衣總抗氧化活性物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取肺衣粉末2.00 g于50 mL具圓底燒瓶中.加入25.00 mL的乙醇，采用回流提取法提取，過(guò)濾倒入具塞錐形瓶中，以提取時(shí)乙醇濃度為溶劑，定容至50.00 mL作為待測(cè)液.

1.2.3 云南肺衣提取物清除羥自由基的抗氧化能力測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[6-7]，PBS試液中含40%乙醇，其方法為：量取5.00 mL PBS(50 mmol/L，下同)、2.00 mL蒸餾水和3.00 mL乙醇于試管中，混勻作為空白參比管(A空參)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL鄰二氮菲(7.50 mmol/L，下同)、1.00 mL FeSO4(7.50 mmol/L，下同)、2.00 mL乙醇和1.00 mL蒸餾水于試管中，混勻作為未損傷管(A未損)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL鄰二氮菲、1.00 mL FeSO4、2.00 mL乙醇和1.00 mL H2O2(0.1%)于試管中，混勻作為損傷管(A損傷)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL樣品液、2.00 mL蒸餾水和2.00 mL乙醇于試管中，混勻作為樣品參比管(A參比)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL鄰二氮菲、1.00 mL FeSO4、1.00 mL乙醇、1.00 mL樣品液和1.00 mL H2O2于試管中，混勻作為樣品管(A樣參).將上述試管同時(shí)置恒溫水浴鍋中，37 ℃保溫60 min，于536 nm處測(cè)吸光度(A)值，每管重復(fù)3次，取其平均值，計(jì)算對(duì)羥自由基清除率：

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 云南肺衣乙醇提取物清除羥自由基抗氧化活性單因素影響

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)抗氧化活性的影響

以60%乙醇溶液為溶劑，料液比為1∶10，回流溫度為60 ℃，改變提取時(shí)間，其余按1.2.3節(jié)對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1.由圖1可知：·OH清除率隨著回流時(shí)間的增大而增大，提取時(shí)間為3 h達(dá)到最大，但提取時(shí)間超過(guò)3 h后清除率開(kāi)始減少，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶液又有一定的溫度，可能破壞了肺衣中抗氧化物質(zhì)，清除率降低，因此提取時(shí)間控制在3 h內(nèi)較為合適.

2.1.2 提取溫度對(duì)抗氧化活性的影響

提取條件為料液比1∶10，提取時(shí)間3 h，改變回流溫度，對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定如前，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2，由圖2可知：清除率隨回流溫度的增大而增大，提取溫度60 ℃為達(dá)到最大，但溫度超過(guò)60 ℃后清除率開(kāi)始下降，可能是活性物質(zhì)在高溫受損，因此回流溫度控制在60 ℃內(nèi)較為合適.

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)抗氧化活性的影響

提取條件為料液比1∶10，提取時(shí)間3 h，回流溫度60℃，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%，對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定如前，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3.圖3中可看出，清除率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，體積分?jǐn)?shù)在60%～70%時(shí)增加的比較快，體積分?jǐn)?shù)大于70%后得率開(kāi)始減小，故選用乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%比較適宜.

2.1.4 料液比對(duì)抗氧化活性的影響

提取條件:提取時(shí)間3 h，回流溫度60℃，乙醇濃度為70%，改變料液比，料液比按1∶5、1∶8、1∶10、1∶15分別提取，對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定如前，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可看出，清除率在開(kāi)始時(shí)隨料液比的增大而減小,因此料液比不宜過(guò)小，以1∶5比較合適.

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，準(zhǔn)確稱(chēng)取云南肺衣粉末2.00 g，以不同的提取時(shí)間、溫度、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為考察的4個(gè)因素.各取3個(gè)水平，選用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[ 8-9 ]，以·OH清除率為指標(biāo)，研究這幾個(gè)因素對(duì)羥自由基清除率的影響，因素水平和實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析分別見(jiàn)表2、表3.

表1 提取料液比對(duì)云南肺衣乙醇提取物抗氧化活性的影響

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

從極差分析結(jié)果可以看出，各因素對(duì)羥自由基清除率影響的主次順序?yàn)椋篋>C>A>B.即乙醇體積分?jǐn)?shù)>料液比>提取時(shí)間>提取溫度，最佳提取條件為：D3C1A2B2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶5、提取時(shí)間3 h、溫度60 ℃.

2.3 精密度的測(cè)定

選取正交設(shè)計(jì)分析的最佳提取工藝條件，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，對(duì)羥自由基清除率如表4.

表4 羥自由基清除率與分析 %

2.4 質(zhì)量濃度換算

準(zhǔn)確量取6 mL提取液，置于水浴中烘干，準(zhǔn)確稱(chēng)量，得出原始提取溶液質(zhì)量濃度為0.027 mg/mL.

2.5 提取物對(duì)羥自由基清除能力

羥基自由基(·OH)是已知的最強(qiáng)的氧化劑，具有極強(qiáng)的反應(yīng)性.由圖4看出，云南肺衣提取物對(duì)·OH清除率的上升與質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，IC50值為14.7 mg/mL.

2.6 提取物抗氧化有效成分的初步鑒定

對(duì)肺衣植物提取物進(jìn)行定性預(yù)實(shí)驗(yàn)[10]，結(jié)果見(jiàn)表5，從表5可初步判斷出提取物中的活性成分歸屬，含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸、多糖等.

表5 云南肺衣提取物抗氧化活性成份的初步鑒定

在定性實(shí)驗(yàn)檢出的幾種成份中，酚類(lèi)、鞣質(zhì)具有酚羥基的結(jié)構(gòu)，酚羥基化合物清除自由基的最主要機(jī)制是：酚羥基與自由基反應(yīng)可形成穩(wěn)定半酮式自由基結(jié)構(gòu)，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[10-11].有機(jī)酸的抗氧化化用近年來(lái)受到關(guān)注[12-13]，它具有清除自由基、抗氧化等作用，對(duì)其它抗氧化劑具有協(xié)同增效作用，因此肺衣植物提取物含有的酚類(lèi)、有機(jī)酸等成分構(gòu)成了其抗氧化作用的物質(zhì)基礎(chǔ).

3 結(jié)語(yǔ)

研究了蒼山云南肺衣乙醇提取物的抗氧化能力，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，得到提取的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%、料液比為1∶5、溫度60 ℃、提取時(shí)間3 h，提取物對(duì)羥自由基清除率96.9%，提取物對(duì)·OH的IC50為14.7 mg/mL.肺衣中含有酚類(lèi)、鞣質(zhì)、多糖、有機(jī)酸.

[1] 張海娟.五種植物的化學(xué)成分及其生物活性研究[D].濟(jì)南:山東大學(xué),2007.

[2] 張海娟,歐揚(yáng),婁紅祥.光肺衣的化學(xué)成分研究[J].中藥材,2007,30(6):651-655.

[3] 李波,林中文,孫漢董.針芽肺衣的化成學(xué)成[J].云南植物研究,1990,12(4):447-451.

[4] 陳瑾歆,唐聰明.氧自由基的研究進(jìn)展[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,10(3):206-208.

[5] 譚榀新,葉濤,劉湘新,等.植物提取物抗氧化成分及機(jī)理研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2010,31(15):288-292.

[6] 金鳴,蔡亞欣,李金榮,等.鄰二氮菲-Fe2+氧化法檢測(cè)H2O2/Fe2+產(chǎn)生的羥自由基[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,1996,23(6):553-557.

[7] 郭雪峰,岳永德,孟志芬,等.用清除羥自由基法評(píng)價(jià)竹葉提取物抗氧化能力[J].食品科學(xué),2008,28(7):1578-1582.[8] 貝玉祥,郭英,和萬(wàn)芬,等.訶子中總多酚含量的測(cè)定及其超聲提取工藝的研究[J].生物技術(shù),2008,18(2):82-84.

[9] 朱慧,馬瑞君,吳雙桃,等.薇甘菊總黃酮的提取及清除羥自由基活性的測(cè)定[J].光譜學(xué)與光譜分析,2010,31(6):70-73.

[10] 高云濤,戴建輝,王雪梅,等.雙水相分離與超聲提取耦合從冬瓜籽中提取抗氧化活性物質(zhì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34(11):180-184 .

[11] 楊春濤,曾曉麗,戴建輝,等.麻櫟樹(shù)皮多酚量的測(cè)定及抗氧化活性的研究[J].云南民族大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2014,23(6):404-407.

[12] MARKOVIC J M,IGNJATOVIC L M,MARKOVI D A,et al. Antioxidative capabilities of some organic acids and their co-pigments with malvin,Part II[J]. Journal of electroanalytical chemistry,2003,553(30):177-182.

[13] 楊錦華,李博,籍保平.我國(guó)常見(jiàn)食用和藥用植物的抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2006,27(6):87-90.

(責(zé)任編輯 莊紅林)

Extracting technology and antioxidant activities of bio-active components from Lobaria yunnanensis

LIU Man-hong1,2，LIU Xiao-fang1,2，DAI Jian-hui1,2，YANG Hua-lun1,2,HE Xue-yang1,2

(1．Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan，Yunnan Minzu University，Kunming 650500,China；2．Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650031,China)

The extracting technology and antioxidant activities of Lobaria yunnanensis were studied. The results showed that the optimal parameters of the extraction technology were the following: the concentration of ethanol was 70%,the ratio of the extraction sample to the solution was 1∶5,the extraction temperature was 60 ℃,the extraction time was 3 0 h. The extraction under these conditions presented a hydroxyl free radical scavenging ratio of 96.9%. IC50of scavenging ·OH for the extracts of Lobaria yunnanensis was 14.7 mg/mL.

Lobaria yunnanensis; extracting technology; antioxidant activity; hydroxyl free radical

2015-01-09.

國(guó)家民委科研資助項(xiàng)目(12YNZ007)；云南民族大學(xué)化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(2013HXSRT08).

劉滿(mǎn)紅(1962-)，女，碩士，教授,碩士生導(dǎo)師．主要研究方向:物理化學(xué).

R284

A

1672-8513(2015)02-0140-04