郭 硯，孫 娟，王麗雯

本研究創(chuàng)新點(diǎn):

藏雪蓮是高原地區(qū)傳統(tǒng)的珍貴藏藥，被藏族人民視為“圣藥”。本研究依據(jù)青海省高海拔、強(qiáng)紫外線和缺氧的地理環(huán)境，且其居住人群長(zhǎng)期暴露于強(qiáng)紫外線環(huán)境，易導(dǎo)致皮膚光老化，以人角質(zhì)形成細(xì)胞 (HaCaT細(xì)胞)作為研究對(duì)象，采用臺(tái)盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞形態(tài)及死亡情況，MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽 (GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、過(guò)氧化氫酶 (CAT)活力，探討藏雪蓮水提取物對(duì)中波紅斑效應(yīng)紫外線 (UVB)所引起的HaCaT細(xì)胞光老化的保護(hù)作用，為青藏高原藥材的開(kāi)發(fā)和實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時(shí)為藏雪蓮光保護(hù)作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

皮膚老化是人體衰老的一個(gè)重要表現(xiàn)，皮膚老化分為兩種:一種是固有性老化，一種是由環(huán)境因素，如紫外線、吸煙、風(fēng)吹等引起的外源性老化。皮膚每天均接受來(lái)自日光中紫外線的輻射，長(zhǎng)期的紫外線輻射導(dǎo)致皮膚發(fā)生形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和生理學(xué)的改變，稱之為光老化。陽(yáng)光中紫外線分為3種:長(zhǎng)波黑斑效應(yīng)紫外線(UVA)(320～400 nm)、中波紅斑效應(yīng)紫外線 (UVB)(280～319 nm)、短波滅菌紫外線 (UVC)(100～279 nm)，UVB是引起輻射損傷的最重要因素，主要損傷皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞 (HaCaT細(xì)胞)，增加皮膚組織中活性氧 (ROS)的生成量，進(jìn)而產(chǎn)生超氧陰離子，使細(xì)胞內(nèi)的過(guò)氧化氫 (H2O2)大量增多，H2O2分解產(chǎn)生大量自由基，引起一系列的氧化損傷［1］，誘導(dǎo)皮膚光老化的發(fā)生。藏雪蓮屬菊科鳳毛菊屬雪蓮亞屬的草本植物，又名雪蓮花，是中國(guó)西部高山特有的多年生草本植物，具有除濕散寒、通筋活血、強(qiáng)筋助陽(yáng)的功效，民間多用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、婦女小腹冷痛、胎衣不下、閉經(jīng)、麻痹不透、肺寒咳嗽、高山不適應(yīng)癥等治療［2］，且有研究證實(shí)，藏雪蓮水提取物能夠增加小白鼠組織內(nèi)超氧化物歧化酶 (SOD)活力［3］、增加谷胱甘肽 (GSH)含量［4］、降低丙二醛 (MDA)含量［3，5］，從而發(fā)揮抗氧化作用。但藏雪蓮水提取物對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞抗氧化損傷作用尚未見(jiàn)報(bào)道。故本研究主要探討藏雪蓮水提取物對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞抗氧化損傷作用，為藏雪蓮水提取物對(duì)UVB光保護(hù)作用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 藏雪蓮購(gòu)自青海眾康醫(yī)藥連鎖有限公司，HaCaT細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;10%胎牛血清 (FBS)購(gòu)自Biological Industries，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品 (北京)有限公司，胰酶購(gòu)自Solarbio公司，臺(tái)盼藍(lán)染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma生物公司，MTS購(gòu)自Promega公司，SOD測(cè)試盒、GSH測(cè)試盒、MDA測(cè)試盒、過(guò)氧化氫酶 (CAT)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司，IX71型Olympus倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司，飛利浦TL20W/12紫外線UVB燈管購(gòu)自上海杰圖商貿(mào)有限公司，UV-340A UVB輻照度監(jiān)視器購(gòu)自北京精密儀器科技有限公司，X-Mark型BIO-RAD酶標(biāo)儀購(gòu)自BIORAD公司。

1.2 藏雪蓮水提取物的制備 根據(jù)文獻(xiàn) ［3］，準(zhǔn)確稱取100 g藏雪蓮 (經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系陳湘宏副教授鑒定)，加入蒸餾水浸泡過(guò)夜 (料液比為1∶5)，加熱至100℃后，文火 (85℃)煎煮2 h，每隔15 min攪拌1次，過(guò)濾，濾渣加蒸餾水后繼續(xù)煎煮，重復(fù)3次，過(guò)濾，合并濾液，冷凍干燥得藏雪蓮水提取物。

1.3 HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng) 根據(jù)文獻(xiàn) ［6］，HaCaT細(xì)胞以含10%FBS的DMEM為培養(yǎng)基 (內(nèi)含10 U/ml青霉素和10 U/ml鏈霉素)，接種于培養(yǎng)瓶后，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱，當(dāng)細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)用以傳代，取3～5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 當(dāng)HaCaT細(xì)胞達(dá)到85% ～90%融合時(shí)，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞按1×106ml細(xì)胞濃度轉(zhuǎn)到96孔板或6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，分為低劑量輻射組 (30 mJ/cm2，輻射1 h)、高劑量輻射組 (60 mJ/cm2，輻射1 h)，低劑量輻射組進(jìn)一步分為對(duì)照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮 1 g/L)、L-UVB+高劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮5 g/L)，高劑量輻射組進(jìn)一步分為對(duì)照組、H-UVB組、H-UVB+低劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮1 g/L)、H-UVB+高劑量臧雪蓮組 (臧雪蓮5 g/L)。UVB輻射前1 h將HaCaT細(xì)胞用無(wú)菌PBS洗滌3遍，并加入不同濃度藏雪蓮水提取物于細(xì)胞培養(yǎng)基中，對(duì)照組用錫紙包住置暗處，其他組細(xì)胞打開(kāi)培養(yǎng)皿蓋在預(yù)設(shè)好的UVB輻射儀中照射1 h后，立即用無(wú)菌PBS洗滌3遍，并加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 臺(tái)盼藍(lán)染色 將經(jīng)含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后的96孔板，用無(wú)菌PBS洗滌3遍，各組細(xì)胞中每孔加入 0.4% 臺(tái)盼藍(lán) 50 μl，3 min，IX71 型Olympus倒置顯微照相系統(tǒng)觀察并攝片。

1.5.2 MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將經(jīng)含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)18 h后的96孔板各孔加入MTS溶液20 μl，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育3 h。終止培養(yǎng)后，酶標(biāo)儀上選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)值。

1.5.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力檢測(cè) 選UVB輻射后損傷較輕組，按照南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的測(cè)試盒說(shuō)明書檢測(cè)SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Sigma Plot 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果 倒置顯微鏡顯示，UVB照射1 h后，L-UVB組與對(duì)照組比較，HaCaT細(xì)胞出現(xiàn)輕度腫脹、漂浮，但仍可看出細(xì)胞形態(tài)，且HaCaT細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量增加;L-UVB+低劑量臧雪蓮組與L-UVB組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)色數(shù)量未下降，細(xì)胞仍有水腫現(xiàn)象，脫片現(xiàn)象仍存在，但可見(jiàn)正常細(xì)胞形態(tài);L-UVB+高劑量臧雪蓮組與L-UVB組比較，HaCaT細(xì)胞藍(lán)色數(shù)量下降，細(xì)胞水腫程度減輕，并且L-UVB+高劑量臧雪蓮組細(xì)胞形態(tài)接近對(duì)照組。H-UVB組與對(duì)照組比較，HaCaT細(xì)胞明顯腫脹，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象，且細(xì)胞形態(tài)已模糊不清;H-UVB+低劑量臧雪蓮組和H-UVB+高劑量臧雪蓮組與H-UVB組比較，HaCaT細(xì)胞依然明顯腫脹，仍有細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象，且細(xì)胞形態(tài)模糊不清 (見(jiàn)圖1)。

圖1 各組HaCaT細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果 (×10)Figure 1 Results of Trypan blue staining of HaCaT cells in each group

2.2 MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中L-UVB組A值較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較L-UVB組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)表 1)。對(duì)照組、H-UVB組、H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中H-UVB組A值較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較H-UVB組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表 2)。

表1 低劑量輻射組MTS比色法檢測(cè)A值比較 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

表1 低劑量輻射組MTS比色法檢測(cè)A值比較 (±s)Table 1 Comparison of A value by MTS test among four subgroups ofL-UVB group

注:L-UVB=低劑量中波紅斑效應(yīng)紫外線，A值=吸光度;與對(duì)照組比較，*P ＜0.05;與L-UVB組比較，△P ＜0.05

組別 例數(shù) A值對(duì)照組 5 2.15 ±0.14 L-UVB組 5 1.22 ±0.12*L-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 1.69 ±0.08△L-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 2.24 ±0.09△F 129.85 P值值＜0.001

表2 高劑量輻射組MTS比色法檢測(cè)A值比較 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

表2 高劑量輻射組MTS比色法檢測(cè)A值比較 (±s)Table 2 Comparison of A value by MTS test among four subgroups of H-VUB group

注:H-UVB=高劑量中波紅斑效應(yīng)紫外線;與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與H-UVB組比較，△P ＜0.05

組別 例數(shù) A值對(duì)照組 5 2.16 ±0.05 H-UVB組 5 0.55 ±0.01*H-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 0.94 ±0.03△H-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 1.99 ±0.09△F 值＜0.001 912.81 P值

2.3 SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力檢測(cè)結(jié)果 臺(tái)盼藍(lán)染色及MTS比色法結(jié)果顯示，藏雪蓮水提取物對(duì)H-UVB損傷的保護(hù)作用較弱，因此選用低劑量輻射組進(jìn)行抗氧化損傷研究，對(duì)照組、L-UVB組、L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);其中L-UVB組SOD活力、GSH含量、CAT活力較對(duì)照組降低，MDA含量較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);L-UVB+低劑量臧雪蓮組GSH含量較L-UVB組降低、MDA含量較L-UVB組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05);L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB組和L-UVB+低劑量臧雪蓮組升高，MDA含量較L-UVB組和L-UVB+低劑量臧雪蓮組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表3)。

表3 低劑量輻射組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

表3 低劑量輻射組SOD活力、GSH含量、MDA含量、CAT活力比較(±s)Table 3 Comparison of SOD activity，GSH content，MDA content andCAT acivity among four subgroups of L-UVB group

注:SOD=超氧化物歧化酶，GSH=谷胱甘肽，MDA=丙二醛，CAT=過(guò)氧化氫酶;與對(duì)照組比較，*P＜0.05;與L-UVB組比較，△P＜0.05;與L-UVB+低劑量臧雪蓮組比較，▲P ＜0.05

組別 例數(shù) SOD活力 GSH含量 MDA含量 CAT 5 21.26 ±0.66 6.84 ±0.14 3.85 ±1.36 25.00 ±3.05 L-UVB組 5 17.36 ±1.48* 4.55 ±0.21* 8.25 ±1.02* 8.40 ±0.94*活力對(duì)照組L-UVB+低劑量臧雪蓮組 5 18.30±0.84 3.45±0.15△ 14.92 ±0.84△ 6.86±1.39 L-UVB+高劑量臧雪蓮組 5 29.65±1.78△▲ 8.01±0.27△▲ 6.94 ±0.24△▲ 34.21±4.33△▲F 241.00 895.88 218.43 135.25 P值值＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

藏雪蓮產(chǎn)于青藏高原海拔3 000～6 000 m雪山雪線碎石間，在藏醫(yī)藏藥上藏雪蓮花作為藥物已有悠久的歷史，是藏族常用的一種民間藥物，在藏族古代藥物文獻(xiàn)《月王藥珍》《西部醫(yī)典》《西北域記》《蘭琉璃》《晶珠本草》及清代《本草綱目拾遺》中均有記載［7-8］。UVB可損傷HaCaT細(xì)胞，增加皮膚組織中ROS的生成量，激活還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，進(jìn)而產(chǎn)生超氧陰離子，使細(xì)胞內(nèi)的H2O2大量增多，H2O2分解產(chǎn)生大量自由基，引起一系列的氧化損傷［1，9-10］，進(jìn)而誘導(dǎo)皮膚光老化。目前，藏雪蓮水提取物在UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞抗氧化損傷方面的作用未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，低劑量輻射組HaCaT細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后出現(xiàn)輕度腫脹、漂浮，藍(lán)染細(xì)胞數(shù)量增加，高劑量輻射組UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞氧化損傷更嚴(yán)重，出現(xiàn)細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)模糊不清，且無(wú)論是低劑量臧雪蓮還是高劑量臧雪蓮均不能減輕UVB對(duì)HaCaT細(xì)胞的氧化損傷，表現(xiàn)為給予藏雪蓮水提取物后HaCaT細(xì)胞形態(tài)仍模糊不清，細(xì)胞明顯腫脹，細(xì)胞死亡成碎片及脫片現(xiàn)象嚴(yán)重，而L-UVB+低劑量臧雪蓮組細(xì)胞形態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞藍(lán)染數(shù)量亦明顯下降，細(xì)胞死亡碎片及脫片現(xiàn)象明顯改善;MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，L-UVB+低劑量臧雪蓮組、L-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較L-UVB組升高，H-UVB+低劑量臧雪蓮組、H-UVB+高劑量臧雪蓮組A值較H-UVB組升高，說(shuō)明藏雪蓮水提取物能夠促進(jìn)HaCaT細(xì)胞在UVB損傷后的增殖。

本研究結(jié)果顯示，L-UVB組SOD活力、GSH含量、CAT活力較對(duì)照組降低，MDA含量較對(duì)照組升高，與既往實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似［3-5］。L-UVB+低劑量臧雪蓮組GSH含量較L-UVB組降低、MDA含量較L-UVB組升高;L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB組升高，MDA含量較L-UVB組降低;L-UVB+高劑量臧雪蓮組SOD活力、GSH含量、CAT活力較L-UVB+低劑量臧雪蓮組升高，MDA含量較L-UVB+低劑量臧雪蓮組降低。說(shuō)明L-UVB+低劑量臧雪蓮不能減輕UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞造成的輻射損傷，而L-UVB+高劑量臧雪蓮能夠減輕UVB輻射對(duì)HaCaT細(xì)胞造成的輻射損傷。但結(jié)合MTS比色法檢測(cè)結(jié)果可知L-UVB+低劑量臧雪蓮可以促進(jìn)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的增生，但卻沒(méi)有抗氧化保護(hù)作用，可能由于低劑量輻射組與HaCaT細(xì)胞孵育時(shí)間太短，但其原因有待進(jìn)一步研究。

本研究闡述藏雪蓮水提取物對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，提出了低劑量藏雪蓮水提取物與HaCaT細(xì)胞提前孵育1 h不能減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞氧化損傷，而高劑量藏雪蓮水提取物可以減輕氧化損傷，為進(jìn)一步探討藏雪蓮水提取物在UVB的光保護(hù)作用的研究提供理論基礎(chǔ)。

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