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胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/阿霉素中miR-185的表達(dá)及對細(xì)胞多藥耐藥性的影響

2015-07-25 05:01:06檀碧波范立僑劉慶偉
中國全科醫(yī)學(xué) 2015年17期
關(guān)鍵詞:細(xì)胞株抑制率耐藥

李 勇,檀碧波,范立僑,趙 群,王 冬,劉 羽,劉慶偉

胃癌發(fā)病率近年有所下降,但仍居消化道惡性腫瘤首位?;熓俏赴┚C合治療的主要措施之一,而較強(qiáng)的多藥耐藥性(MDR)常造成胃癌化療失敗,患者預(yù)后較差[1-2]。胃癌MDR的發(fā)生機(jī)制和逆轉(zhuǎn)研究是目前研究的熱點,但尚未取得重要進(jìn)展。近期microRNA在惡性腫瘤中的作用已成為腫瘤發(fā)病機(jī)制及治療的研究熱點,有研究發(fā)現(xiàn)某些microRNA在胃癌MDR中發(fā)揮作用,也有研究顯示microRNA-185(miR-185)與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲及MDR有關(guān)[3-5],但miR-185與胃癌MDR關(guān)系的相關(guān)研究報道較少。本研究檢測了胃癌細(xì)胞株SGC7901和耐阿霉素 (ADR)的細(xì)胞株SGC7901/ADR中miR-185表達(dá)情況,并應(yīng)用 miR-185模擬物轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR,初步探討了miR-185參與胃癌MDR的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 病理資料 選取2014年3—5月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行胃癌切除術(shù)的20例患者胃癌及癌旁組織標(biāo)本?;颊吣?4例,女6例;年齡36~73歲,平均年齡 (56.6±9.0)歲;術(shù)前均經(jīng)胃內(nèi)鏡病理活檢確診?;颊咝g(shù)后TNM分期為ⅡB~ⅢC期,均為中高分化腺癌?;颊咝g(shù)前均未接受放化療等治療。術(shù)中腫瘤切除后取胃癌組織和癌旁組織 (距離腫瘤邊緣大于3 cm,術(shù)后病理證實無癌細(xì)胞存在)各1份,1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm,置于液氮中保存,盡快轉(zhuǎn)入-80℃深低溫冰箱,用于后續(xù)實驗。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞株及試劑 人胃腺癌細(xì)胞株SGC7901由本院科研中心保種,正常胃上皮細(xì)胞株GES-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所,細(xì)胞株SGC7901/ADR由第四軍醫(yī)大學(xué)消化病研究所樊代明院士惠贈。RPMI 1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶購自美國Gibco公司;Trizol試劑、脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑購自美國Promega公司;PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成;miR-185模擬物購自美國AB公司;miR-185熒光定量PCR檢測試劑盒購自美國GeneCopia公司;蛋白提取試劑盒購自美國Bio-rad公司;MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP及 GAPDH抗體購自美國Santa Cruz公司;MTT試劑購自美國Sigma公司;ADR購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司,10 mg/支;5-氟尿嘧啶 (5-FU)購自西安海欣制藥有限公司,250 mg/支;草酸鉑 (LOHP)購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,50 mg/支。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),2~3 d傳代1次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化分散后計數(shù),制成細(xì)胞懸液備用。SGC7901/ADR細(xì)胞在含有0.4 mg/L的ADR中培養(yǎng)以維持其耐藥表型。

1.4 miR-185模擬物合成及轉(zhuǎn)染 細(xì)胞株SGC7901/ADR以密度為4×105個/ml接種于6孔板,置入37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染前用無血清無抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)液清洗細(xì)胞,用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的miR-185模擬物或無關(guān)對照序列以及轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體,混合靜置后轉(zhuǎn)染SGC7901/ADR細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后,取轉(zhuǎn)染效率>90%的細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 細(xì)胞株SGC7901/ADR體外藥敏試驗 分別將ADR、5-FU、L-OHP加入經(jīng)miR-185模擬物或無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SGC7901/ADR各6個復(fù)孔,置入37℃、95%濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。

于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl。培養(yǎng)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液,各孔加入150 μl DMSO,室溫振蕩15 min,采用酶標(biāo)儀于波長490 nm處測定吸光度值 (OD值)。以上實驗重復(fù)3次。計算各藥物對細(xì)胞株SGC7901/ADR的抑制率,抑制率=(對照OD值-待測OD值)/對照OD值,其中對照OD值由未加入藥物的細(xì)胞株SGC7901/ADR同步培養(yǎng)測定。

1.6 細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA及各細(xì)胞株miR-185表達(dá) 采用Trizol一步法提取總RNA,取2 μg反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。取 2 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μl SYBR Green Mix、多藥耐藥基因上下游引物各0.5 μl,按試劑盒說明建立終體積為20 μl的PCR體系。PCR熱循環(huán)參數(shù)為:95℃ 5 min,94℃30 s,60℃ 30 s,進(jìn)行45個循環(huán)。應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計多藥耐藥基因引物序列:MDR1/P-gp(F):5'-GTGGGGCAAGTCAGTTCATT-3', (R):5'-TCTTCACCTCCAGGCTCAGT-3';MRP-1(F):5'-GGGGTCCTCATTATCTTCTGG-3', (R):5'-TGGTCTCAGGGTAGGGGTTAG-3';GST-π(F):5'-GGAGACCTCACCCTGTACCA-3', (R):5'-GGCTAGGACCTCATGGATCA -3';LRP (F):5'-ACCAACCCTGACGACAGAAG-3', (R):5'-CATGTCTCCCGATCTCTGGT-3'。內(nèi)參基因GAPDH(F):5'-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3', (R):5'-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3'。采 用 2-ΔΔCt法 計 算 各 基 因mRNA的相對表達(dá)水平。各細(xì)胞株miR-185表達(dá)同樣采用上述熒光定量PCR測定,嚴(yán)格按microRNA檢測試劑盒說明進(jìn)行。

1.7 細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥蛋白表達(dá) 采用Western blotting法測定多藥耐藥蛋白相對表達(dá)水平。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SGC7901/ADR培養(yǎng)24 h后提取總蛋白,進(jìn)行蛋白定量后,取60 μg于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,置入TBST配制的5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別用稀釋后的多藥耐藥蛋白一抗或內(nèi)參一抗4℃孵育過夜,經(jīng)TBST漂洗3次后,加相應(yīng)辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h,化學(xué)發(fā)光法顯色,對條帶進(jìn)行積分吸光度掃描,計算多藥耐藥蛋白相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以 (±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-185相對表達(dá)水平比較 癌旁組織和胃癌組織miR-185相對表達(dá)水平分別為 (0.910±0.142)、 (0.243±0.045),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=20.025,P<0.001)。細(xì)胞株GES-1、SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相對表達(dá)水平分別為 (0.903 ± 0.117)、 (0.630 ± 0.101)和 (0.191±0.030),差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (F=46.850,P<0.001)。其中,細(xì)胞株SGC7901、SGC7901/ADR miR-185相對表達(dá)水平低于GES-1,細(xì)胞株SGC7901/ADR miR-185相對表達(dá)水平低于 SGC7901(P<0.05)。

2.2 各藥物對不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR的抑制率 ADR、5-FU和L-OHP對不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR抑制率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。其中,ADR、5-FU和L-OHP對miR-185模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SGC7901/ADR抑制率高于未轉(zhuǎn)染和無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 (P<0.05,見表1)。

2.3 細(xì)胞株SGC7901/ADR經(jīng)轉(zhuǎn)染后多藥耐藥基因mRNA相對表達(dá)水平 經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理后,細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因LRP mRNA相對表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理后,細(xì)胞株SGC7901/ADR多耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相對表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。其中,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π mRNA相對表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)染和無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 (P<0.05,見表2)。

表1 各藥物對不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR抑制率的比較(±s,%,n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

表1 各藥物對不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR抑制率的比較(±s,%,n=3)Table 1 Comparison of inhibition rate of drugs on cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉(zhuǎn)染比較,*P<0.05;與無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染比較,△P<0.05;ADR=阿霉素,5-FU=5-氟尿嘧啶,L-OHP=草酸鉑

處理因素37.2 ±5.7 40.9 ±6.0 36.6 ±4.4無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 38.9±5.0 42.7 ±5.3 38.3±5.0 miR-185模擬物轉(zhuǎn)染 74.7±9.7*△ 81.7±5.4*△ 69.5±7.2*△F ADR 5-FU L-OHP未轉(zhuǎn)染0.001 <0.001 <0.001 26.800 50.640 31.770 P值值

表2 不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA相對表達(dá)水平的比較 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表2 不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因mRNA相對表達(dá)水平的比較 (±s)Table 2 Comparison of multidrug resistance gene mRNA relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉(zhuǎn)染比較,*P<0.05;與無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染比較,△P<0.05

處理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未轉(zhuǎn)染 0.980±0.101 0.876±0.116 0.951±0.073 1.117±0.121無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 0.969±0.148 0.853±0.103 0.910±0.099 1.027±0.125 miR-185模擬物轉(zhuǎn)染 0.253±0.038*△ 0.325±0.061*△ 0.566±0.065*△ 1.119±0.187 F 值<0.001 <0.001 0.002 0.699 46.565 31.472 20.791 0.383 P值

2.4 細(xì)胞株SGC7901/ADR經(jīng)轉(zhuǎn)染后多藥耐藥基因蛋白相對表達(dá)水平 經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理后,細(xì)胞株SGC7901/ADR LRP蛋白相對表達(dá)水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。經(jīng)不同轉(zhuǎn)染處理后,細(xì)胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相對表達(dá)水平比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。其中,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株SGC7901/ADR MDR1/P-gp、MRP-1和GST-π蛋白相對表達(dá)水平低于未轉(zhuǎn)染和無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 (P<0.05,見表3)。

3 討論

胃癌是我國常見的惡性腫瘤,治療效果不佳,其重要原因是胃癌細(xì)胞的MDR常導(dǎo)致化療失?。?-7],胃癌MDR機(jī)制并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)已成為目前研究的熱點。然而,目前尚未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致胃癌細(xì)胞MDR的關(guān)鍵基因和確切逆轉(zhuǎn)MDR的藥物。因此,尋找在胃癌細(xì)胞MDR中發(fā)揮作用的新基因并分析其作用機(jī)制有重要意義。

表3 不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因蛋白相對表達(dá)水平的比較 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

表3 不同轉(zhuǎn)染處理后的細(xì)胞株SGC7901/ADR多藥耐藥基因蛋白相對表達(dá)水平的比較 (±s)Table 3 Comparison of multidrug resistance protein relative expression levels of cell SGC7901/ADR by different transfected

注:與未轉(zhuǎn)染比較,*P<0.05;與無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染比較,△P<0.05

處理因素 MDR1/P-gp MRP-1 GST-πLRP未轉(zhuǎn)染 0.777 ±0.110 0.825 ±0.105 0.807±0.069 0.534±0.069無關(guān)對照序列轉(zhuǎn)染 0.799 ±0.121 0.799 ±0.118 0.790±0.097 0.560±0.075 miR-185模擬物轉(zhuǎn)染 0.367±0.055*△ 0.326±0.035*△ 0.433±0.066*△ 0.520±0.079 F 值0.003 0.001 0.002 0.807 17.904 27.133 21.670 0.221 P值

microRNA由于對下游基因具有強(qiáng)大的調(diào)節(jié)功能而成為近期腫瘤研究的熱點。研究表明,miR-21、let-7、miR-27等多個microRNA均與胃癌相關(guān)[8-10]。miR-185是新近發(fā)現(xiàn)與惡性腫瘤關(guān)系密切的microRNA,參與多種惡性腫瘤的增殖、侵襲、遷移,并與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性相關(guān)[3-5]。而關(guān)于miR-185與胃癌MDR關(guān)系目前研究很少。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織miR-185相對表達(dá)水平低于癌旁組織,耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR miR-185相對表達(dá)水平低于正常胃上皮細(xì)胞株GES-1和胃腺癌細(xì)胞株SGC7901,提示miR-185可能參與胃癌MDR的發(fā)生。以miR-185模擬物轉(zhuǎn)染細(xì)胞株SGC7901/ADR,使miR-185表達(dá)上調(diào),細(xì)胞對化療藥物的敏感性明顯增強(qiáng),證實miR-185參與了胃癌MDR調(diào)節(jié),上調(diào)miR-185有逆轉(zhuǎn)胃癌細(xì)胞MDR特性的作用,有可能成為今后治療胃癌的靶基因,具有進(jìn)一步深入研究的價值。

miR-185參與胃癌MDR的機(jī)制在于miR-185可介導(dǎo)其靶基因沉默,故本研究進(jìn)一步從分子水平對miR-185上調(diào)后細(xì)胞中胃癌MDR基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π、LRP的mRNA及其蛋白表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測。MDR1/P-gp、MRP-1基因是腫瘤MDR經(jīng)典途徑的代表基因,其表達(dá)蛋白存在于腫瘤細(xì)胞膜上,可將化療藥物泵出細(xì)胞外而導(dǎo)致MDR[11-12];GST-π蛋白具有降解細(xì)胞內(nèi)藥物的功能,能使藥物解毒成為無害物質(zhì)而排出細(xì)胞外[13];LRP則可以阻止藥物進(jìn)入細(xì)胞核或?qū)⑺幬锉贸黾?xì)胞核外,后通過胞吐作用將藥物排 出 細(xì) 胞[14]。本 研 究 發(fā) 現(xiàn),細(xì) 胞 株 SGC7901/ADR經(jīng)miR-185模擬物轉(zhuǎn)染,多藥耐藥基因MDR1/P-gp、MRP-1、GST-π mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低,提示,miR-185對上述胃癌MDR基因具有抑制作用。同時,miR-185模擬物轉(zhuǎn)染并未影響LRP的表達(dá),說明miR-185可能僅通過調(diào)節(jié)部分胃癌MDR基因而參與胃癌MDR。

綜上所述,胃癌細(xì)胞miR-185表達(dá)下調(diào),通過上調(diào)miR-185的表達(dá)可提高胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性,其機(jī)制可能是miR-185調(diào)控部分多藥耐藥基因的表達(dá)。本研究結(jié)論提示miR-185有可能成為胃癌治療的新靶點,但本研究僅從分子水平進(jìn)行了體外實驗,且miR-185對MDR基因調(diào)控的具體機(jī)制尚不完全明確,有待進(jìn)一步體內(nèi)研究及分子間作用機(jī)制研究予以闡明。

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