劉 玲，李瑞芳，段冷昕，何 玲

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南洛陽(yáng)471003；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京210009)

新型孕激素衍生物3α-羥基-3β-甲氧基甲基-16，17-亞甲基-孕甾-20-酮對(duì)硝普鈉損傷PC12細(xì)胞的保護(hù)作用

劉 玲1，李瑞芳1，段冷昕1，何 玲2

(1.河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，河南洛陽(yáng)471003；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇南京210009)

目的探討新型孕激素衍生物3α-羥基-3β-甲氧基甲基-16，17-亞甲基-孕甾-20-酮(CPU)對(duì)硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法用終濃度為0.01，0.10，1.00 μmol·L－1的CPU預(yù)處理30 min，然后加入SNP共同作用24 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，分光光度計(jì)法檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)漏出率、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧(ROS)、線粒體膜電位和細(xì)胞凋亡率；Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與細(xì)胞對(duì)照組比較，SNP模型組PC12細(xì)胞的存活率顯著降低，LDH的釋放明顯增加(P＜0.01)，MDA生成增多，SOD活性降低，ROS水平升高，線粒體膜電位水平降低，細(xì)胞凋亡率由細(xì)胞對(duì)照組(1.20±0.14)%增加至(55.52±3.56)%(P＜0.01)；Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而B(niǎo)ax表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值升高，同時(shí)胱天蛋白酶3被激活(P＜0.01)。與模型組比較，CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1作用24 h后，細(xì)胞存活率顯著升高，LDH的釋放減少(P＜0.01)，MDA的生成量減少，SOD活性增加，ROS累積減少，線粒體膜電位水平升高(P＜0.01)；凋亡細(xì)胞分別降至(37.79±4.85)%，(22.31±4.25)%和(10.39± 2.65)%；Bcl-2蛋白表達(dá)增加，Bax和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)降低。結(jié)論CPU對(duì)SNP所致?lián)p傷的PC12細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化和抗凋亡作用有關(guān)。

神經(jīng)甾體；神經(jīng)保護(hù)；細(xì)胞凋亡；硝普鈉

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.003

腦卒中是一種以微循環(huán)血流量下降及葡萄糖和能量代謝障礙為主要特征的老年性疾病，氧化損傷在神經(jīng)毒性機(jī)制研究中占有重要地位。神經(jīng)活性甾體是指神經(jīng)組織中具有活性的所有甾體激素，包括神經(jīng)甾體和外周內(nèi)分泌腺分泌的甾體激素，如孕烯醇酮及其硫酸鹽、孕酮、別孕烯醇酮和脫氫表雄酮等[1－2]。神經(jīng)甾體、其代謝物以及它們的合成類似物具有麻醉、催眠、抗癲癇、擾焦慮、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶和改善認(rèn)知能力等作用[3－4]。以神經(jīng)甾體激素為靶點(diǎn)的新藥研究多集中在以下兩個(gè)方面:①以神經(jīng)類固醇母核為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出結(jié)構(gòu)類似、口服吸收更好、生物利用度更高的神經(jīng)類固醇類化合物；②選擇性地影響體內(nèi)神經(jīng)類固醇合成、代謝及轉(zhuǎn)化酶活性的藥物，可以糾正神經(jīng)類固醇的失調(diào)、恢復(fù)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)平衡，又可避免直接應(yīng)用類固醇激素所產(chǎn)生的副作用。3α-羥基-3β-甲氧基甲基-16，17-亞甲基-孕甾-20-酮(3α-hydroxy-3β-methoxymethyl-16，17-methylene-pregna-20-keto，CPU)是以神經(jīng)類固醇母核為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的一種新型孕激素衍生物(圖1)。研究表明，氧化應(yīng)激在多種病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，如心血管疾病、腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。而一氧化氮(nitric oxide，NO)可與氧分子相互作用生成活性氮族(reactive nitrogen species，RNS)，包括二氧化氮(NO2)、三氧化二氮(N2O3)和四氧化二氮(N2O4)，RNS可與蛋白通過(guò)氧化作用引起組織損傷；NO可與超氧陰離子結(jié)合形成過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO－)，誘導(dǎo)DNA損傷、脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白降解和通過(guò)半胱氨酸殘基的S-亞硝?；饔?，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡；ONOO－還可與H＋形成ONOOH，繼而迅速分解成許多毒性代謝產(chǎn)物如羥自由基(OH－)等[5－6]。超氧陰離子、H2O2和OH－統(tǒng)稱為活性氧(reactive oxygen species，ROS)。RNS和ROS均可造成細(xì)胞毒性。研究表明，硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭锌舍尫懦鯪O，引起神經(jīng)細(xì)胞損傷[7－8]。前期研究顯示，CPU對(duì)Aβ25－35和H2O2損傷模型均有一定的保護(hù)作用[9]。研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制與炎癥介質(zhì)釋放、氧化應(yīng)激水平過(guò)高均有一定的關(guān)系[10]。神經(jīng)損傷的病理狀態(tài)下，大量ROS的產(chǎn)生可以促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的表達(dá)；而在神經(jīng)損傷后期，神經(jīng)元型NO合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導(dǎo)型NOS (inducible NOS，iNOS)可產(chǎn)生高濃度NO，進(jìn)一步加劇神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷[11]。因此，本研究通過(guò)SNP所致PC12細(xì)胞損傷模型，觀察CPU對(duì)神經(jīng)炎癥損傷中氧化應(yīng)激和凋亡作用的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物、細(xì)胞和試劑

CPU為孕激素衍生物(相對(duì)分子質(zhì)量374.57)由中國(guó)藥科大學(xué)向華副教授提供，純度＞90%，溶于二甲亞砜(DMSO)配制成100 mmol·L－1的母液，用時(shí)加PBS稀釋至所需濃度。

PC12細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。SNP注射液(130502，北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司)；胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、小牛血清和四甲基偶氮唑鹽(MTT)(美國(guó)Gibco公司)；AnnexinⅤ-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(均南京建成生物工程研究所)；ROS以及JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞裂解液和BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(均碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3、β肌動(dòng)蛋白和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)購(gòu)于美國(guó)Bioworld公司。其余試劑均為市售分析純。

1.2 儀器

SW-CJ-2J潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Electron公司；SH-1000 Lab全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，日本日立公司；BD FACSCanto流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。DYY-11B型三恒電泳儀和DYCP-31DN型電泳儀，均北京市六一儀器廠；Clinx ChemiScope2850熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5% CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后，傾去培養(yǎng)液，用D-Hanks液輕輕蕩洗2次，加入適量的0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化3～5 min后加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，用吸管輕輕吹打數(shù)次，使細(xì)胞分散成單細(xì)胞懸液，按5×108L－1的密度，每孔200 μL傳代隨機(jī)接種于預(yù)先用明膠處理過(guò)的96孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

參照文獻(xiàn)[8]建立SNP損傷模型。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、SNP 100 μmol·L－1模型組及CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1＋SNP組。每組6孔，每孔200 μL，待細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按分組分別換液，培養(yǎng)24 h。CPU預(yù)處理30 min后加入SNP共同作用24 h。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

取1.4處理的細(xì)胞，每孔加入20 μL MTT 5 g·L－1，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入DMSO 150 μL，振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為570 nm處測(cè)定每孔的吸光度(absorbance，A570nm)值，記錄結(jié)果并計(jì)算PC12細(xì)胞的存活率。存活率(%)＝(給藥組A570nm/細(xì)胞對(duì)照組A570nm)×100%。

1.6 比色法檢測(cè)LDH，MDA和SOD水平

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞制成2×108L－1懸液，置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)。按照1.4處理細(xì)胞。24 h后取細(xì)胞上清液，按LDH測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，比色法于450 nm處測(cè)定A并計(jì)算LDH釋放量。

收集經(jīng)藥物處理后的細(xì)胞，并懸浮于0℃生理鹽水，冰浴中用超聲細(xì)胞破碎儀完全破碎細(xì)胞(20 kHz，2 min)，顯微鏡下觀察無(wú)細(xì)胞后分別取一定量的細(xì)胞懸液，按MDA及SOD測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定其A并計(jì)算活性。BCA法定量蛋白。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平

取1.4處理的細(xì)胞，按照1∶1000用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol·L－1。加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，表示細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

1.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位水平

收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用胰酶將細(xì)胞制成2×108L－1懸液，置于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞貼壁后給藥。PBS洗滌2次，4℃，352×g離心5 min，棄上清，重懸于3%DMEM培養(yǎng)基0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中。加入0.5 mL JC-1染色工作液，顛倒數(shù)次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。孵育結(jié)束后，4℃下600×g離心3～4 min，棄上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次后，用適量JC-1染色緩沖液重懸后，用流式細(xì)胞儀分析。JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位的理想熒光探針，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物而產(chǎn)生紅色熒光，在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能形成聚合物，以單體的形式存在，而產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體膜電位的變化程度。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡率

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期狀態(tài)良好的細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配成1.0×106L－1的細(xì)胞懸液后，接種于6孔板中，置恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換用含3%血清的DMEM培養(yǎng)基，加入SNP和藥物繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，4℃下352×g離心5 min，棄上清。加入500 μL的緩沖液懸浮細(xì)胞。加入5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙啶，混勻。室溫下避光反應(yīng)20 min。1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀的觀察和檢測(cè)。

1.10 Western蛋白印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

取1.4處理的細(xì)胞，收集細(xì)胞并用裂解液裂解細(xì)胞獲得總蛋白。采用BCA試劑盒于562 nm處測(cè)定樣品蛋白含量。然后，采用12%濃度的SDSPAGE分離總蛋白，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉過(guò)的膜用TBST洗滌3次。將膜放入雜交袋中，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，使抗原抗體充分結(jié)合。隔天，將膜從雜交袋中取出，用TBST洗滌3次；再放入新雜交袋中，加入二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜2 h?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照成像。以目的蛋白積分吸光度值與內(nèi)參吸光度值的比值表示某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CPU對(duì)SNP損傷PC12細(xì)胞存活率的影響

表1結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，SNP模型組的細(xì)胞存活率明顯下降(P＜0.01)，為(40.8± 4.5)%。CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1能明顯抑制SNP所致的PC12細(xì)胞損傷，存活率分別為(55.8±3.9)%，(66.6±5.0)%和(80.0±5.4)%。表明SNP可造成PC12細(xì)胞損傷，而CPU對(duì)SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷有一定的抑制作用。

Tab.1 Effect of CPU on cell viability of PC12 cells treated with sodium nitroprusside(SNP)

2.2 CPU對(duì)SNP損傷PC12細(xì)胞LDH，MDA和SOD活性的影響

表2結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，SNP模型組培養(yǎng)液內(nèi)LDH的釋放量增加了117%；同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA生成顯著增多而抗氧化酶SOD活性降低了46%；CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1對(duì)LDH的釋放量分別減少了16%，39%和50%；MDA的生成量分別減少了31%，60%和83%；SOD活性分別增加了9%，24%和46%。表明CPU可減輕SNP造成的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

Tab.2 Effect of CPU on lactate dehydrogenase (LDH)，malondialdehyde(MDA)and superoxide dismutase(SOD)in PC12 cells treated with SNP

2.3 CPU對(duì)SNP損傷PC12細(xì)胞ROS水平的影響

表3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，SNP模型組中ROS的平均熒光強(qiáng)度水平明顯升高了383% (P＜0.01)；加入CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1后，能明顯減少ROS的累積，熒光強(qiáng)度分別降低了18%，44%和63%(P＜0.01)。結(jié)果提示，CPU可減少SNP導(dǎo)致的PC12細(xì)胞損傷后所引起ROS累積。

Tab.3 Effect of CPU on reactive oxygen species (ROS)production of PC12 cells treated with SNP by flow cytometry

2.4 CPU對(duì)SNP損傷PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

圖2和表4結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，SNP模型組線粒體膜電位水平顯著降低，紅綠熒光比值顯著下降(P＜0.01)；加入CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1后，線粒體膜電位水平逐漸升高，紅綠熒光比值呈升高趨勢(shì)(P＜0.05，P＜0.01)。結(jié)果提示，CPU可通過(guò)提高線粒體膜電位，從而減輕SNP所致PC12細(xì)胞的線粒體損傷。

Tab.4 Effect of CPU on mitochondrial membrane potential of PC12 cells treated with SNP

2.5 CPU對(duì)SNP損傷PC12細(xì)胞凋亡的影響

圖3和表5結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組凋亡細(xì)胞相比，SNP損傷模型組細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.01)，加入CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1，細(xì)胞的凋亡率較SNP模型組明顯降低(P＜0.01)，提示CPU對(duì)SNP誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。

Fig.2 Effect of CPU on mitochondrial membrane potential(MMP)of PC12 cells treated with SNP.See Tab.1 for the treatment.A:cell control；B:SNP 100 μmol·L－1；C－E:CPU 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L－1＋SNP 100 μmol·L－1，respectively.

Fig.3 Effect of CPU on apoptosis of PC12 cells treated with SNP.See Tab.1 for the treatment.A:cell control；B:SNP 100 μmol·L－1；C－E:CPU 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L－1＋SNP 100 μmol·L－1，respectively.

Tab.5 Effect of CPU on apoptosis rate of PC12 cells treated with SNP

2.6 CPU對(duì)PC12細(xì)胞SNP損傷蛋白表達(dá)的影響

圖4結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，SNP模型組中Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而B(niǎo)ax表達(dá)升高，Bax/Bcl-2比值由細(xì)胞對(duì)照組的0.27±0.07升高至1.36±0.18，同時(shí)胱天蛋白酶3被激活，蛋白表達(dá)由細(xì)胞對(duì)照組0.20±0.05升高至1.12±0.12；與SNP模型組相比，加入CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1后，可增加Bcl-2表達(dá)，減少Bax表達(dá)，Bax/Bcl-2比值分別降低至0.49±0.14，0.81±0.14和1.14± 0.15，胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)降低至0.33±0.05，0.65±0.13和0.89±0.09。結(jié)果表明，CPU減輕SNP所致的PC12細(xì)胞損傷，可能與其抗凋亡有關(guān)。

Fig.4 Effect of CPU on expression of Bcl-2，Bax and cleaved-caspase-3 protein in PC12 cells by Western blotting.See Tab.1 for the treatment.B and C were the semiquantitative results of A.IA:integrated absorbance.Lane 1:cell control；lane 2:SNP group；lanes 3－5:SNP＋CPU 1.00，0.10 and 0.01 μmo·lL－1groups.compared with cell control group；compared with SNP group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，SNP可造成PC12細(xì)胞氧化損傷以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而新型孕激素衍生物CPU可顯著升高細(xì)胞存活率，減少LDH釋放和MDA生成，增加SOD活性，減少ROS累積，升高線粒體膜電位水平；使Bcl-2蛋白表達(dá)增加、Bax和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)降低，從而降低細(xì)胞凋亡的發(fā)生。表明CPU對(duì)SNP所致的損傷有一定的保護(hù)作用。

SNP是NO的供體，可以在水溶液中快速釋放出NO，直接造成PC12細(xì)胞損傷[12－13]。NO可與超氧陰離子自由基發(fā)生快速反應(yīng)，生成強(qiáng)氧化性的過(guò)氧化亞硝基，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生膜脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)氧化及DNA損傷[14]。細(xì)胞受損后使膜通透性提高，LDH和MDA等物質(zhì)釋放到胞漿中，進(jìn)一步加劇了細(xì)胞的損傷。本研究中SNP 100 μmol·L－1可顯著降低PC12細(xì)胞的存活率，增加LDH漏出率，引起MDA水平升高，而抗氧化酶SOD活性降低。上述結(jié)果表明，SNP增加了脂質(zhì)過(guò)氧化物的生成，抑制抗氧化酶的活性，改變了氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡，引起了細(xì)胞存活率降低。CPU 0.01，0.10和1.00 μmol·L－1作用PC12細(xì)胞24 h后，可提高損傷細(xì)胞存活率，減少LDH漏出量和MDA的生成，提高SOD活性，提示CPU對(duì)PC12細(xì)胞SNP損傷模型的保護(hù)作用與其抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用、增加抗氧化酶活性有關(guān)。

ROS包括氧自由基、過(guò)氧化氫及下游產(chǎn)物氧化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。NO可與超氧陰離子結(jié)合形成過(guò)氧亞硝酸鹽(ONOO－)，產(chǎn)生大量ROS，ROS爆發(fā)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，引起膜電位下降甚至消失，同時(shí)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，引起線粒體內(nèi)容物如細(xì)胞色素c等因子釋放，最終激活胱天蛋白酶3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。另外，在凋亡過(guò)程中，線粒體膜電位是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要指標(biāo)，其下降預(yù)示細(xì)胞線粒體受到損傷；細(xì)胞內(nèi)的Bax與Bcl-2比值決定了線粒體外膜孔道的形成，而胱天蛋白酶3直接參與了染色體凝聚和DNA片段化等過(guò)程，是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵執(zhí)行者[16]。SNP可增加PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低線粒體膜電位，升高Bax/Bcl-2比值，激活胱天蛋白酶3。上述結(jié)果表明，SNP可提高PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，引起線粒體膜電位水平下降，破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步產(chǎn)生大量的ROS，從而攻擊DNA引起細(xì)胞損傷。另一方面，SNP通過(guò)降低抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，同時(shí)引起促凋亡蛋白Bax在線粒體上易位，最終激活胱天蛋白酶3啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。CPU可減少ROS累積，提高線粒體膜電位，降低Bax/Bcl-2比值，減少胱天蛋白酶3的活化，從而減少SNP損傷引起的細(xì)胞凋亡，提示CPU的保護(hù)作用可能是通過(guò)增強(qiáng)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制Bax蛋白表達(dá)，從而抑制Bax二聚體的形成，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抗凋亡的作用。

綜上所述，SNP對(duì)PC12細(xì)胞具有損傷作用，其損傷機(jī)制可能與細(xì)胞膜損傷、氧化應(yīng)激水平升高、線粒體結(jié)構(gòu)和功能紊亂，以及相關(guān)抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)降低、促凋亡蛋白Bax和胱天蛋白酶3表達(dá)增高有關(guān)。新型孕激素衍生物CPU對(duì)上述SNP造成的損傷具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其抗氧化和抗凋亡有關(guān)。本研究為神經(jīng)甾體及其代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系的研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期找到作用專屬性強(qiáng)、活性好、毒性低的化合物用于某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，并有望在這方面取得更大的進(jìn)展。

[1] Schüle C，Eser D，Baghai TC，Nothdurfter C，Kessler JS，Rupprecht R.Neuroactive steroids in affective disorders:target for novel antidepressant or anxiolytic drugs?[J].Neuroscience，2011，191:55-77.

[2] Bicíková M，Hampl R.Neurosteroids and their function[J].Cas Lek Cesk，2007，146(3):223-226.

[3] Schüle C，Nothdurfter C，Rupprecht R.The role of allopregnanolone in depression and anxiety[J].Prog Neurobiol，2014，113:79-87.

[4] Zhang LN，Hao L，Wang HY，Su HN，Sun YJ，Yang XY，et al.Neuroprotective effect of resveratrol against glutamate-induced excitotoxicity[J].Adv Clin Exp Med，2015，24(1):161-165.

[5] Savidge TC.Importance of NO and its related compounds in enteric nervous system regulation of gut homeostasis and disease susceptibility[J].Curr Opin Pharmacol，2014，19:54-60.

[6] Pe?a-Altamira E，Petazzi P，Contestabile A.Nitric oxide control of proliferation in nerve cells and in tumor cells of nervous origin[J].Curr Pharm Des，2010，16(4):440-450.

[7] Chen X，Deng A，Zhou H，Gu J.Neuroprotective effect of 2-(4-methoxyphenyl)ethyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-pyranoside againstsodiumnitroprusside-induced neurotoxicity in HT22 cells[J].Mol Cell Biochem，2013，383(1-2):149-159.

[8] Pandareesh MD，Anand T.Neuroprotective and anti-apoptoticpropensityofBacopamonnieraextract against sodium nitroprusside induced activation of iNOS，heat shock proteins and apoptotic markers in PC12 cells[J].Neurochem Res，2014，39(5):800-814.

[9] Liu L，He L，Xiang H.Protective effects of neurosteroids on PC12 damage[J].Shangdong Med J(山東醫(yī)藥)，2010，30(10):1391-1393.

[10] Hsieh HL，Yang CM.Roleof redox signaling in neuroinflammation and neurodegenerative diseases[J].Biomed Res Int，2013，2013:484613.

[11] Pe?a-Altamira E，Petazzi P，Contestabile A.Nitric oxide control of proliferation in nerve cells and in tumor cells of nervous origin[J].Curr Pharm Des，2010，16(4):440-450.

[12] Bátor J，Varga J，Berta G，Barbakadze T，Mikeladze D，Ramsden J，et al.Sodium nitroprusside，a nitric oxide donor，fails to bypass the block of neuronal differentiation in PC12 cells imposed by a dominant negative Ras protein[J].Cell Mol Biol Lett，2012，17(3):323-332.

[13] Mu?oz M，Bermejo-Bescós P，Romero C，Benedí J，Martín-Aragón S.SNP-mediated neuroprotection under glucose deprivation is enhanced byHypericum perforatum[J].CNS Neurol Disord Drug Targets，2012，11(2):162-173.

[14] Shiva S.Nitrite:a physiological store of nitric oxide and modulator of mitochondrial function[J].Redox Biol，2013，1(1):40-44.

[15] Kim SF.Theroleof nitric oxide in prostaglandin biology；update[J].Nitric Oxide，2011，25(3): 255-264.

[16] Zeng KW，Wang XM，Ko H，Yang HO.Neuroprotective effect of modified Wu-Zi-Yan-Zong granule，a traditional Chinese herbal medicine，on CoCl2-induced PC12 cells[J].J Ethnopharmacol，2010，130(1):13-18.

Protective effect of 3α-hydroxy-3β-methoxymethyl-16，17-methylenepregna-20-keto on PC12 cells injured by sodium nitroprusside

LIU Ling1，LI Rui-fang1，DUAN Leng-xin1，HE Ling2
(1.Department of Pharmacy，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China；2.Department of Pharmacology，China Pharmaceutical University，Nanjing210009，China)

OBJECTlVETo investigate the protective effects of a novel progesterone derivative，3α-hydroxy-3β-methoxymethyl-16，17-methylene-pregna-20-keto(CPU)，on PC12 cell damage models induced by sodium nitroprusside(SNP).METHODSPC12 cells were pretreated with CPU 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L－1for 30 min before SNP 100 μmol·L－1was added to the medium for 24 h.The colorimetric MTT assay was used to evaluate cell viability.The transudation content of lactate dehydrogenase (LDH)was observed by colorimetry reaction，the degree of injury to PC12 cells was evaluated by measuring the blank content of malondialdehyde(MDA)in conditioned medium，and the activity of superoxide dismutase(SOD)in cells was measured by kits.The levels of intracellular reactive oxygen species (ROS)were quantified by the Reactive Oxygen Species Assay Kit.The mitochondrial membrane potential was investigated with the fluorescent probe JC-1.The apoptosis rate was assayed by FITC-AnnexinⅤ/PI staining while the protein expression of Bcl-2，Bax，and cleaved caspase 3 was measured by Western blotting.RESULTSCompared with blank control group，the survival rate of PC12 cells decreased to(40.8±4.5)%(P＜0.01)，LDH release increased from(75.6±3.4)U·L－1to(165.2±6.4)U·L－1(P＜0.01)；the MDA activity significantly increased，SOD activities were significantly decreased(P＜0.01)，the generation of ROS was increased and the levels of MMP were decreased，the rate of apoptosis increased from(1.20±0.14)%to(55.52±3.56)%(P＜0.01)，the positive rate of Bcl-2 decreased while the positive rate of Bax and cleaved caspase 3 increased(P＜0.01)，respectively，in SNP model group. Compared with SNP model group，after 24 h of incubation with CPU 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L－1，PC12 cell survival rate increased to(55.8±3.9)%，(66.6±5.0)%and(80.0±5.4)%(P＜0.05)，respectively，LDH release was reduced to 137.6±21.4，100.8±14.5 and(82.5±11.3)U·L－1，respectively，the activities of antioxidant enzyme SOD were increased while lipid peroxidation(MDA)production was decreased.CPU 0.01，0.10 and 1.00 μmol·L－1could reduce the accumulation of ROS and increase the levels of mitochondrial membrane potential.The rate of apoptosis decreased to(37.79±4.85)%，(22.31±4.25)%and (10.39±2.65)%(P＜0.01).CPU could up-regulate Bcl-2，down-regulate Bax and activate caspase 3(P＜0.01).CONCLUSlONCPU protects PC12 cells from SNP injury models probably via anti-oxidation and anti-apoptosis.

neurosteroids；neuroprotection；apoptosis；sodium nitroprusside

LIU Ling，Tel:(0379)64830345，E-mail:liuling921＠126.com

R966

:A

:1000-3002(2015)04-0545-07

2014-09-05 接受日期:2015-03-09)

(本文編輯:喬 虹)

劉 玲，博士，副教授，主要從事生化藥理學(xué)研究。

劉 玲，Tel:(0379)64830345，E-mail: liuling921＠126.com