任艷　江晨　王輝等

摘要：利用5種發(fā)根農桿菌侵染不同花生外植體，對比其發(fā)根誘導率，分析尋找利于花生轉化的外植體、花生品種及發(fā)根農桿菌。結果表明，農桿菌94022誘導發(fā)根率較其它發(fā)根農桿菌高；后期繼代培養(yǎng)中子葉誘導的發(fā)根易于培養(yǎng)，存活率高，生長狀態(tài)好；在用培養(yǎng)后的子葉為外植體時，花育20較其它品種發(fā)根誘導率高。

關鍵詞：發(fā)根農桿菌；花生；外植體；發(fā)根誘導

中圖分類號：S565.204.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2015）01-0014-03

Abstract Five kinds of Agrobacterium rhizogenes were used to infect peanut explants and the root induction rates were contrasted to find the suitable explants， peanut varieties and A. rhizogenes for peanut transformation. The results showed that A. rhizogenes 94022 had higher root induction rate than the others. The hairy roots induced from cotyledon were easy to cultivate in the successive transfer culture with higher survival rate and good growth condition. With cultured cotyledon as explants， Huayu 20 had higher root induction rate than other peanut varieties.

Key words Agrobacterium rhizogenes； Peanut； Explants； Hairy root induction

發(fā)根農桿菌能誘導大多數雙子葉植物和少數單子葉植物[1]，發(fā)根農桿菌所含Ri質粒的T-DNA通過整合進入植物核基因組，并穩(wěn)定表達引起宿主植物發(fā)根[2]。發(fā)根起源于單個細胞，具有生長迅速、遺傳穩(wěn)定、有利于高效表達克隆的篩選等特點[3]。用含改造型Ri質粒的發(fā)根農桿菌感染植物細胞可將目的基因導入植物組織再生出轉基因植株[4]。并根據插入位點的多樣性篩選出高效表達的發(fā)根無性系進行生產和利用，是進行次生代謝物質離體調控和大規(guī)模生產的良好體系[5]。

花生是世界上廣泛種植的經濟作物之一，是我國第二大食用植物油和蛋白質資源[6]。同時花生的根和莖等外植體中含有白藜蘆醇[7]，建立花生發(fā)根培養(yǎng)體系對尋求白藜蘆醇的新資源也有重要意義。本試驗以5種發(fā)根農桿菌和5個花生品種及其不同部位外植體為材料，分析尋找利于花生轉化的外植體、花生品種及發(fā)根農桿菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試花生品種：魯花9號、豐花1號、花育20、魯花11、花育22。所用發(fā)根農桿菌：S22、Ar-1、Ar-2、9402、94022。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

試劑有乙酰丁香酮、頭孢霉素、卡那霉素、利福平；培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、YEB培養(yǎng)基。

1.3 無菌外植體的獲得

分別將5個花生品種的種子在70%乙醇中浸泡1 min，用無菌水沖洗1次，然后用0.1%升汞浸泡10 min，再用無菌水清洗4次，每次4～5 min。之后種于MS培養(yǎng)基進行無菌萌發(fā)，6～8 d后長出無菌苗。

1.4 發(fā)根農桿菌菌株的活化與培養(yǎng)

分別將發(fā)根農桿菌Ar-1、Ar-2 和S22接種于添加50 mg/L卡那霉素的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，將發(fā)根農桿菌94022和9402接種于添加50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，27℃下活化3次。挑取平板上的單菌落，接種在同樣添加抗生素的50 mL 的YEB液體培養(yǎng)基上，27℃、170 r/min黑暗下振蕩培養(yǎng)16～18 h→在5個菌瓶中分別加入AS 1 000 μL→在27℃、170 r/min黑暗下振蕩培養(yǎng)1 h→在A600達到 0.5～0.8時侵染外植體。

1.5 外植體轉化及毛狀根誘導

取滅菌后花生子葉和生長6～8 d的花生無菌苗子葉、幼葉、下胚軸、莖，各材料切成0.3～0.5 cm，并在外植體表面輕輕劃出幾道傷口，分別置于發(fā)根農桿菌菌液（已培養(yǎng)的5種）中浸泡（幼葉：10～15 min；子葉、下胚軸、莖：15～20 min）后取出，用無菌濾紙吸干外植體表面多余菌液，接種于發(fā)根誘導培養(yǎng)基MSo，于黑暗條件下共培養(yǎng)2 d。之后轉接到附加500 mg/L頭孢菌素的發(fā)根誘導培養(yǎng)基5MSo上培養(yǎng)3～5 d，然后轉至附加300 mg/L頭孢菌素的發(fā)根誘導培養(yǎng)基3MSo上培養(yǎng)12～15 d，再轉至無抗生素的發(fā)根培養(yǎng)基上誘導發(fā)根。侵染1個月后觀察統計發(fā)根誘導率。

發(fā)根誘導率=產生發(fā)根的外植體數/接種外植體總數×100%

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)根農桿菌的發(fā)根誘導效果

由表1可看出，發(fā)根農桿菌94022的平均發(fā)根誘導率最高為54.75%，其次是9402，為46.84%，Ar-1最低為32.81%。說明發(fā)根農桿菌94022最適宜誘導花生外植體發(fā)根。

2.2 不同花生外植體的發(fā)根誘導

由表1可看出，5種花生外植體均可誘導出發(fā)根，莖和下胚軸相對其它外植體其發(fā)根誘導率較高，其次是培養(yǎng)后的花生子葉，幼葉的發(fā)根誘導率最低。后續(xù)發(fā)根繼代培養(yǎng)發(fā)現花生子葉誘導的發(fā)根，生長迅速，成活率高，容易擴繁。綜合比較，選擇花生培養(yǎng)后的子葉為發(fā)根誘導外植體較為合適。endprint

2.3 不同花生品種的發(fā)根誘導

以花生培養(yǎng)后子葉為外植體誘導發(fā)根時，5種發(fā)根農桿菌侵染不同花生品種的發(fā)根誘導率都以花育20為最高（表1），其中9402的誘導率為68.96%，94022的誘導率為83.20%，S22的誘導率為89.04%，Ar-1的誘導率為93.70%，Ar-2的誘導率為50.17%。

3 結論與討論

常用的發(fā)根農桿菌對不同的植物毛狀根誘導能力存在差異。Fabricio等[8]采用3種發(fā)根農桿菌ATCC15834、R1000、EHA105均誘導出毛狀根。Kim等[9]采用發(fā)根農桿菌ATCC15834、A4、R1000、R1200、R1601等菌株誘導發(fā)根。姚慶收等[10]采用發(fā)根農桿菌R1601誘導，子葉沒有誘導出毛狀根，幼葉誘導率達65.6%，莖干誘導毛狀根生長緩慢。劉杰等[11]采用發(fā)根農桿菌ACCC10060和ATCC11325誘導發(fā)根，葉片最高誘導率為53.3%。任艷等[12]采用發(fā)根農桿菌GIM1.141誘導發(fā)根，葉片誘導率為87.29%，子葉誘導率為75.8%。

本試驗通過對比不同菌種和花生外植體，找到了相對適宜的組合來誘導發(fā)根進行擴繁培養(yǎng)。即用發(fā)根農桿菌94022侵染花育20的培養(yǎng)后子葉進行發(fā)根誘導，其發(fā)根誘導率相對較高，為83.20%，發(fā)根的后期繼代培養(yǎng)存活率高，容易擴繁。

參 考 文 獻：

[1]Binns A N，Tomashow M F. Cell biology of Agrobacterium infection and transformation of plants[J]. Annul. Rev. Microbiol.，1988，42（4）：575-606.

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[3]McKnight T D，Lillis M T，Simpson R B. Segregation of genes transferred to one plant cell from two separate Agrobacterium strains[J]. Plant Mol. Biol.，1987，8：439-445.

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[9]Kim J S，Lee S Y，Park S U. Resveratrol production in hairy root culture of peanut. Arachis hypogaea L. transformed with different Agrobacterium rhizogenes strains[J]. Afr. J. Biotechnology，2008，17：3785-3787.

[10]姚慶收，武玉永，王學全. 發(fā)根農桿菌介導的花生遺傳轉化體系的建立[J]. 安徽農業(yè)科學，2008，36（35）：15367-15368.

[11]劉杰，任艷，張宗申，等. 花生毛狀根誘導及其體外培養(yǎng)[J]. 安徽農業(yè)科學，2012，40（6）：3229-3233.

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